生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍

生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍

真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。在生

物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。

真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转

化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。

在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白

质药物。植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。

在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。

转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。

一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因

子和调控序列等元件。一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。

除了基因导入和表达的技术要求，真核细胞表达系统还需要注重生物反应器的选择和细胞培养条件的优化。对于植物细胞表达系统，传统的反应器选择包括大型容器培养（如发酵罐）和搅拌型生物反应器。而对于动物细胞表达系统，一般采用可控的生物反应器，如液体悬浮培养或固定床培养等。

在真核细胞表达系统中，蛋白质的纯化和检测也是至关重要的步骤。常用的纯化技术包括柱层析、凝胶过滤、电泳和亲和纯化等。此外，酶联免疫吸附试验（ELISA）和西方印迹（Western blot）是常用的蛋白质检测方法，用于定量和鉴定表达的蛋白质。

总之，真核细胞表达系统在生物制药技术中扮演着重要的角色。植物细胞表达系统和动物细胞表达系统都具有各自的优势和适用范围，可以根据需要选择合适的宿主细胞和技术平台。随着基因工程和生物制药技术的不断发展，真核细胞表达系统将在未来的生物制药领域中发挥更大的作用。

真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)

真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域： Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1 3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子和多克隆位点区域：

CHO细胞表达系统

CHO细胞表达系统原理 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。 针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。 但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物

真核细胞表达系统(干货分享)

真核细胞表达系统 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段. 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异

性激活或抑制；...文档交流仅供参考... ②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及； ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考... 1、酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Ｃandiｄa Bodｉni，Pichia Pasｔris3种。以Pichia Ｐastoriｓ应用最多。...文档交流仅供参考... 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中ＡOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/Piｃhia Pastoris的穿梭载体，

cho细胞表达系统及筛选原理

cho细胞表达系统及筛选原理 Cho细胞表达系统及筛选原理 一、引言 Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。 二、Cho细胞表达系统的原理 Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。 1. 转染 将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。 2. 选择性筛选 为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。 3. 扩增和表达 经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模

蛋白质表达。通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。 4. 蛋白质纯化 经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。 三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用 Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。 1. 高表达水平 Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。 2. 真核细胞表达 与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。 3. 可选择性筛选 通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。 4. 灵活性

真核细胞表达系统

真核细胞表达系统 常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。 1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。 2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。 3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。 哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。常用质粒表达载体如pcMVp-NEO-BAN、pEGFP 等，都以pCMV启动子驱动外源真核蛋白高水平地稳定表达，由于载体有Neo 抗性基因，转染细胞后用G418筛选，可建立稳定高效表达的细胞系。哺乳动物细胞表达常用的宿主细胞有COS、CHO、BHK、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质糖基化有不同的影响，因此选择宿主细胞时应根据具体情况而定。根据不同实验目的，蛋白质可以进行瞬时表达、稳定表达或者一定条件下诱导表达。

生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍

生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍 真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。在生 物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。 真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转 化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。 在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白 质药物。植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。 在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。 转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。 一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因 子和调控序列等元件。一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。

真核表达系统

真核表达系统 原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。 一、优势 1.具转录后加工系统； 2.具翻译后修饰系统； 3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。 二、真核基因结构及表达调控特点： (一)、基因结构特点： 1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)

克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。 2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生 物转录、翻译不可能持续进行。 3.不持续性：内含子、外显子。 内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。 4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。 因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。 5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真 核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。

生物制药技术中的克隆与表达技术应用

生物制药技术中的克隆与表达技术应用 生物制药技术是一项利用生物学方法生产医疗用途药物的技术领域。其中，克 隆与表达技术在生物制药领域中扮演着至关重要的角色。克隆技术通过复制和扩增特定基因或某一片段的DNA，使得大量特定基因的拷贝可以被快速制备出来。表 达技术则通过将克隆的基因导入到合适的表达系统中，使得目标蛋白质得以大量产生。本文将着重介绍克隆与表达技术在生物制药技术中的应用。 在生物制药技术中，克隆技术的应用广泛而重要。首先，通过克隆技术可以获 得携带特定基因的重组质粒。这些重组质粒可以用于转染真核细胞或质粒转化细菌等目的。其次，在克隆技术的帮助下，可以进行基因突变、基因敲除或基因插入等操作。这些操作使得科研人员能够研究目标基因的功能以及与之相关的生物过程。此外，克隆技术还能够用于制备重组疫苗和抗原等重要生物制品。 克隆技术的应用还可以进一步扩展到表达技术的领域。先将克隆的基因插入表 达载体中，然后将表达载体导入到适当的宿主细胞中，就能够实现目标蛋白的大量表达。这对于生物制药领域来说是非常重要的，因为很多药物都是由蛋白质组成的。 在生物制药领域中，表达技术的应用可以实现特定蛋白质的制备和提取。一方面，通过表达技术可以使得药物前体蛋白质得以大量产生，方便后续的纯化和制备。另一方面，表达技术还可以将人体内的蛋白质转化为大量可用于药物治疗的形式。这些蛋白质可以是重要的胰岛素、生长激素等，也可以是抗体等具有治疗潜力的蛋白质。 表达技术在生物制药技术中的应用还可以进一步扩展到新药的研发领域。通过 改变克隆基因组的表达条件，如温度、培养基组分等，可以调控目标蛋白质的表达量和活性。这种方法使得生物制药领域在研发新药时拥有更多的选择和可能性。此外，通过表达技术还可以合成具有特定功能的蛋白质片段或改变蛋白质的结构，从而使得药物具有更好的药效和安全性。

生物制药技术中的表达载体构建方法解析

生物制药技术中的表达载体构建方法解析 在生物制药领域中，表达载体构建是一项关键的技术，它是将目标基因导入宿 主细胞并在细胞内进行表达的重要步骤。通过表达载体构建，研究人员可以实现对目标蛋白质的高效表达和产量的调控。下面将介绍几种常见的表达载体构建方法。 首先，常用的表达载体构建方法是利用质粒（plasmid）进行基因克隆。质粒是一种环状的DNA分子，常见于细菌细胞中，具有自主复制和表达的能力。基因克 隆的第一步是将目标基因插入到质粒载体的多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）中。MCS是质粒上含有多个限制性内切酶切位点的区域，可以方便地进行 基因插入和重组。插入基因后，需要通过酶切和连接技术将其固定到载体上，形成重组质粒，再转化到宿主细胞中进行进一步表达。 其次，表达载体构建中常用的技术是利用哺乳动物细胞的嵌入质粒法。哺乳动 物细胞的表达系统可用于大规模的蛋白质表达，尤其适用于重组蛋白的高效表达。在该方法中，目标基因与哺乳动物表达载体（如pCMV、pcDNA等）分别经过酶切、连接和转基因技术，构建出重组质粒。然后将该重组质粒导入哺乳动物细胞中，由细胞自身的转录和翻译机制实现目标基因的表达和蛋白质的合成。此外，该方法还可以通过调控载体上的启动子和调控子来控制目标基因的表达水平和时机。 另一种常见的表达载体构建方法是利用病毒载体。病毒载体具有高效的基因传 递和表达能力，常用于基因治疗和疫苗研发等领域。常见的病毒载体有腺相关病毒（Adenovirus）、腺病毒（Adeno-associated virus）和慢病毒（Retrovirus）等。构 建病毒载体的方法包括双重感染法和质粒转染法。双重感染法是将目标基因和不同的病毒载体分别进行转染，然后在宿主细胞中进行重组，最终形成重组病毒载体。质粒转染法是将目标基因与病毒相关的质粒导入宿主细胞中，通过质粒中编码的复制和包装相关基因实现重组病毒载体的构建。 此外，还有一种新兴的表达载体构建方法是利用CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9系统是一种基因编辑工具，可以实现对基因组的精确修饰，包括基因敲入、

生物制药中的蛋白表达技术

生物制药中的蛋白表达技术 随着生物技术的不断发展和进步，基因工程技术成为制备重大 药物的重要手段之一，尤其是蛋白质药物的大规模制备和研究。 蛋白表达技术便是制备这些蛋白质药物的重要技术。本文将对生 物制药中的蛋白表达技术进行介绍和探讨。 蛋白质药物在治疗许多疾病中具有重要价值，如疫苗、单克隆 抗体、生长因子、抗凝剂等。然而，这些蛋白质药物在体内的生 产较为困难，需要用到蛋白表达技术。蛋白表达技术通过基因转 录和翻译作用使得蛋白质得以成功表达和大规模生产。 蛋白表达技术中的重要步骤 蛋白表达技术主要分为三个步骤：基因克隆、转染或转化以及 蛋白质表达和纯化。在基因克隆阶段，需要将目标蛋白质的基因 克隆到表达载体中，并在目标受体细胞中进行转染或转化。在转 染或转化阶段，重要的是选择合适的宿主细胞系统、适当的表达 载体和诱导条件。在蛋白质表达和纯化阶段，蛋白质表达的产量、纯度和活性也是关键因素。

宿主细胞系统的选择 宿主细胞系统是纯化和制备蛋白质药物的关键部分，不同的宿 主细胞系统可以用于制备不同类型的蛋白质药物。根据其用途， 常用的宿主系统包括大肠杆菌、哺乳动物细胞和酵母菌等。 大肠杆菌是最常见的细菌宿主体系，其具有简单的基因组结构、快速繁殖和容易操作的优势。由于大肠杆菌是孤儿菌，其并不能 产生人类蛋白质翻译所需的多个修饰酶。因此，通过大肠杆菌的 表达系统表达的蛋白质通常需要经过重组和纯化。 哺乳动物细胞中表达的蛋白质和人体中产生的蛋白质非常相似，因此常用于生产蛋白质药物。哺乳动物细胞中表达的蛋白质质量 较高，纯化产量高，常常被用于生产高质量的治疗蛋白质药物， 如单抗、生长因子等。 酵母菌作为真核细胞，内含有许多人类细胞所拥有的排异因子，可引发免疫反应。一些在哺乳动物体系中不易得到高效表达的异 糖酵母菌，也作为了一种宿主菌株。酵母菌也是其中之一。使用 酵母菌进行蛋白表达和提纯的主要优势是易于操作和纯化，而且

蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点

蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统 及其优缺点 蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白 质来研究其结构和功能。蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。本文将对这两种蛋白质 表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。 一、原核表达系统 原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的 系统。该系统具有以下特点： 1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平 的优势。通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量 的外源蛋白质。 2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。 3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天， 速度较快。这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。 然而，原核表达系统也存在一些缺点： 1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复 杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。

2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻 译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。 3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达 系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。 二、真核表达系统 真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。真核表达系统具有以下特点： 1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。 2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类 蛋白质。 3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达， 适用于工业化生产。 然而，真核表达系统也存在一些缺点： 1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。 2. 更复杂的培养条件：真核生物细胞需要复杂的培养条件，包括特 定的培养基、培养温度和培养时间等。

生物制药中的表达系统选择和使用注意事项

生物制药中的表达系统选择和使用注意 事项 生物制药是一项利用生物学原理和技术来生产药物的领域，其中表 达系统的选择和使用是至关重要的步骤。表达系统是指将目标基因转 录成mRNA并翻译成蛋白质的系统，它直接关系到生物制药中药物产量、质量和效力等方面。在选择和使用表达系统时，需要考虑多种因素，包括目标蛋白的性质、产量要求、系统稳定性和成本效益等。 首先，选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质。不同的蛋白质具 有不同的结构和功能，因此需要根据目标蛋白是否是酶、激素、抗体 等来选择合适的表达系统。例如，如果目标蛋白是细胞内酶，可以考 虑使用大肠杆菌表达系统，因为大肠杆菌对这类蛋白的表达效果较好。而如果目标蛋白是复杂的膜蛋白，可以考虑使用哺乳动物细胞表达系统，因为哺乳动物细胞具有更接近人体细胞的表达环境。 其次，生物制药中的表达系统选择还需考虑产量要求。不同的表达 系统对蛋白质的表达能力有所差异，选择合适的表达系统可以提高蛋 白质的产量。例如，选择细胞系表达系统时，可以选择具有高复制和 表达能力的细胞系，如CHO细胞。此外，一些表达系统还可以通过基 因工程技术增加蛋白质的产量。例如，可以通过插入多个目标基因拷贝、优化启动子序列和信使RNA的稳定性等方式来提高表达系统的产量。

同时，选择表达系统还需要考虑系统的稳定性。所谓稳定性指的是 表达系统能否持续稳定地表达目标蛋白。在生物制药中，长时间和稳 定的表达对于大规模生产药物至关重要。因此，选择具有稳定表达能 力的表达系统非常重要。例如，大肠杆菌表达系统常常因为由于毒力 基因的表达而导致大规模突变，从而降低了系统的稳定性。而哺乳动 物细胞表达系统，虽然表达系统稳定性较高，但细胞系的稳定性会受 到外界环境的影响。 此外，成本效益也是选择表达系统时需要考虑的因素。不同的表达 系统所需的设备、耗材和操作成本都不同。因此，在选择表达系统时，需要综合考虑产量要求和成本效益。对于小规模生产或科研用途而言，大肠杆菌表达系统通常是较为经济的选择；而对于大规模生产企业而言，哺乳动物细胞表达系统可能更具成本效益。 最后，无论选择哪种表达系统，还需要注意一些使用注意事项。首先，要选择合适的启动子和调控元件来控制目标蛋白的表达，以确保 系统能够在所需的时期和条件下表达目标蛋白。其次，要注意对表达 系统进行优化和改良，以提高表达效率和产量。例如，通过剪接工程、信使RNA稳定性调控、蛋白质在细胞内的定位等方式来改善表达系统。最后，要进行系统的监测和分析，以确保蛋白质的质量和纯度，以及 表达系统的稳定性和一致性。 总之，在生物制药中，选择合适的表达系统是至关重要的。通过根 据目标蛋白的性质、产量要求、系统稳定性和成本效益等因素进行综 合考虑，可以选择到最适合的表达系统。在使用表达系统时，还需注 意一些使用注意事项，以确保表达系统能够稳定高效地表达目标蛋白。

生物制药中的新技术及开发

生物制药中的新技术及开发 随着生物技术的不断进步和发展，生物制药的研究和开发也逐渐迈入了新领域。新技术的应用和推广不仅有助于提高生物制药的质量和效果，也能够降低生产成本，进而推动生物制药市场的发展。本文将探讨生物制药中的新技术及其应用。 一、基因工程技术 基因工程技术是利用先进的生物技术手段，通过对基因的改造和调控来实现生 物制药的研发和生产。该技术的应用范围包括基因治疗、表达系统和细胞培养等多个领域。具体来说，基因工程技术的应用可以分为以下几个方面： 1.基因治疗：基因治疗是指将修饰的基因通过特定的介质输送到人体内，使得 患者的细胞或组织发生基因改变，从而治疗疾病。基因治疗主要用于治疗肿瘤、心血管疾病、血液疾病等。 2.表达系统：表达系统是指将外源基因引入到生物细胞中，通过转录和翻译等 过程表达出蛋白质。常用的表达系统包括原核表达系统、真核表达系统等。 3.细胞培养：细胞培养是通过体外培养技术将细胞快速扩增，以进行生物制药 的研发和生产。细胞培养技术广泛应用于疫苗、抗体和生物药生产等领域。 二、蛋白质工程技术 蛋白质工程技术是指通过改造蛋白质的基因序列或二级结构，从而改变其性质 和功能的一种技术。该技术的应用包括重组蛋白质制备、抗体工程等多个领域。具体来说，蛋白质工程技术的应用可以分为以下几个方面： 1.重组蛋白质制备：重组蛋白质制备是指将外源基因引入到生物细胞中，通过 表达系统表达出特定的蛋白质。重组蛋白质制备广泛应用于抗体、激素和酶等生物制药的研发和生产。

2.抗体工程：抗体工程是指通过改造抗体分子的结构和序列，从而改变其活性、亲和力和特异性等属性。抗体工程主要应用于抗体治疗、肿瘤免疫治疗等领域。 三、纳米技术 纳米技术是一种极小尺度的技术，它将物质制备成纳米尺度的物质，并将其应 用于医学和药学等领域。纳米技术的应用范围包括药物制备、生物成像和诊断等多个领域。具体来说，纳米技术的应用可以分为以下几个方面： 1.药物制备：纳米技术可以将药物制备成纳米颗粒形式，从而提高其生物利用 度和药效。此外，纳米技术还可以制备聚集体、纳米管等一系列纳米物质，以扩大药物的递送范围和提高药物的稳定性。 2.生物成像：纳米技术可以制备出可用于生物成像的纳米粒子，以提高成像的 分辨率和灵敏度。在诊断疾病、筛查肿瘤等方面具有广阔的应用前景。 四、CRISPR/Cas9技术 CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因编辑技术，具有精准、快速和高效的特点。该技术可以通过设计CRISPR引物和Cas9核酸酶，将特定的DNA序列粘接并修饰。CRISPR/Cas9技术的应用包括基因突变、基因纠错、基因敲除等多个领域。具体来说，CRISPR/Cas9技术的应用可以分为以下几个方面： 1.基因敲除：CRISPR/Cas9技术可以通过引起特定基因的突变，从而实现基因 敲除和基因静默。此技术广泛应用于生物制药领域的基因治疗和生物制药生产中。 2.基因纠错：CRISPR/Cas9技术可以通过修正某一基因的序列和结构，从而纠 正基因突变和基因缺陷。该技术对于遗传性疾病的治疗有着广泛和潜在的应用前景。 总之，生物制药中的新技术给生物制药的研发和生产带来了一片新天地。开发 合适的技术和应用领域对于推动生物制药市场的发展和生物技术的进步意义重大。未来，随着基因技术、蛋白质技术、纳米技术和CRISPR/Cas9技术等技术的不断 进步，生物制药市场将呈现出更为广阔的发展空间和应用前景。

生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方法详解

生物制药技术中的生长因子的表达与纯化方 法详解 在生物制药技术中，生长因子是一类可以促进细胞增殖、分化和发育的蛋白质 信号分子。它们在医药领域具有广泛的应用，常被用于治疗癌症、遗传性疾病和退行性疾病等。为了获得高纯度的生长因子，生物制药技术中采用了一系列的表达和纯化方法。本文将详细介绍生物制药技术中生长因子的表达与纯化方法。 生长因子的表达是指将相关基因导入到宿主细胞中，通过转录和翻译过程使基 因表达为具有生物活性的蛋白质。表达方法主要有原核表达和真核表达两种。 原核表达是将生长因子基因克隆到大肠杆菌等细菌的表达载体中，通过转化、 培养和诱导等步骤使基因表达为目标蛋白。在原核表达中，由于基因表达系统简单、成本较低且表达量较高，常被用于小规模的试验和研究。然而，细菌中的表达系统无法正确翻译和修饰复杂的生长因子，因此并不适用于大规模生产。 真核表达是将生长因子基因克隆到真核细胞（如哺乳动物细胞）的表达载体中，通过转染、培养和诱导等步骤实现基因表达。相比于原核表达，真核表达能够保留生长因子的天然结构和生物活性，因此更适用于大规模生产。近年来，重组DNA 技术的发展使得真核表达系统的建立更加高效，同时也提高了纯化效率。 表达获得的生长因子需要经过纯化才能得到高纯度的蛋白质。生长因子的纯化 方法一般包括以下几个步骤：细胞破碎、先导蛋白的去除、拟静态层析、亲和层析和尺寸排除层析。 细胞破碎是将表达获得的细胞打破，释放出蛋白质。常用的方法有机械破碎、 超声波破碎和高压破碎等。破碎后的细胞溶液包含了大量的其他蛋白质和杂质，需要进行进一步的纯化。

先导蛋白的去除是为了排除掉无法识别的非生长因子蛋白质。一般采用的方法 是利用具有亲和性的纯化材料（如亲和树脂或金属螯合材料）结合标签或结构域与生长因子结合，以实现生长因子的分离和纯化。 拟静态层析是利用柱层析将目标蛋白与其他蛋白质分离。常用的方法有离子交 换层析、亲和层析和蛋白A/G层析等。通过对样品的特定性质进行调整，可以实 现目标蛋白质的选择性结合和洗脱。 亲和层析是基于生物分子之间特异性的结合作用进行纯化的方法。例如，利用 抗体与目标生长因子之间的特异性结合，可以将目标蛋白质高效地分离出来。这种方法在生物制药领域得到了广泛应用。 尺寸排除层析是一种根据蛋白质分子大小的纯化方法。通过载体的孔径限制， 可以将目标蛋白质与较大的蛋白复合物分离开，达到纯化和富集目标蛋白质的目的。 最后，经过上述纯化步骤，得到的生长因子蛋白质可以经过浓缩、冻干等处理，最终获得高纯度、高活性的生长因子制剂。 总结一下，在生物制药技术中，生长因子的表达与纯化是实现高纯度、高活性 生长因子制备的关键步骤。基因的表达可以通过原核表达和真核表达两种方法实现，其选择取决于具体的实验目的和产品需求。纯化过程包括细胞破碎、先导蛋白去除、拟静态层析、亲和层析和尺寸排除层析等步骤，通过选择性结合和分离，最终获得高纯度的生长因子，为生物制药领域的应用提供了有力的支持。

蛋白质表达与细胞工程生物制药和细胞治疗的前沿技术

蛋白质表达与细胞工程生物制药和细胞治疗 的前沿技术 细胞工程生物制药和细胞治疗是在生物技术领域中具有巨大潜力的 前沿技术。蛋白质表达在这两个领域中起着至关重要的作用。本文将 探讨蛋白质表达技术在细胞工程生物制药和细胞治疗中的应用，并介 绍一些相关的研究进展。 一、细胞工程生物制药中的蛋白质表达 细胞工程生物制药是利用基因工程技术生产具有药物功能的蛋白质。蛋白质表达是这一过程中的核心步骤之一。在细胞工程生物制药中， 常见的蛋白质表达系统包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。 1. 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一。它具有操作简便、生产成本低廉的优势。然而，由于大肠杆菌是原核细胞，与真核 细胞相比在一些蛋白质后翻译修饰方面存在差异，因此对于某些蛋白 质的表达可能存在限制。 2. 酵母表达系统 酵母表达系统是另一种常用的蛋白质表达系统。酵母细胞是真核细胞，其与人类细胞在蛋白质后翻译修饰等方面更加接近。酵母表达系 统通常使用酵母菌属中的酿酒酵母和毕赤酵母。它在表达复杂蛋白质 时具有优势，但生产成本相对较高。

3. 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统是最接近人类细胞的蛋白质表达系统，因此 广泛用于生产重组蛋白质。哺乳动物细胞通常使用CHO细胞、 HEK293细胞等。这些细胞能够正确进行蛋白质后翻译修饰，包括糖基化、磷酸化等，从而获得与人类蛋白质更为相似的产物。 二、细胞治疗中的蛋白质表达 细胞治疗是一种通过植入、修复或替代细胞来治疗疾病的方法。蛋 白质表达在细胞治疗中起着至关重要的作用。通过基因转导技术，可 以使细胞表达特定蛋白质，从而对疾病产生治疗效果。 1. 基因转导技术 基因转导技术是将目标基因导入目标细胞中的一种技术。它可以通 过多种方式实现，如病毒载体介导的转导、基因枪等。通过基因转导 技术，可以使细胞表达特定蛋白质，从而增强其治疗效果。 2. 细胞治疗的应用领域 细胞治疗已经在多个领域显示出巨大的潜力。例如，在癌症治疗中，细胞治疗可以通过激活患者的免疫系统识别和消灭肿瘤细胞。在组织 工程和再生医学领域，细胞治疗可以用于修复损伤的组织和器官。此外，细胞治疗还可以用于治疗一些遗传性疾病，如遗传性免疫缺陷病等。 三、蛋白质表达技术的研究进展

重组蛋白表达系统在生物制药技术中的应用

重组蛋白表达系统在生物制药技术中的应用引言： 生物制药技术是利用生物体制造药物的一种新兴技术。在过去的几十年中，蛋 白表达系统作为一种关键的工具，被广泛应用于生物制药技术中。重组蛋白表达系统是指利用基因工程技术将具有特定功能的基因导入至目标表达系统中，以产生具有理想药效的重组蛋白。本文将重点讨论重组蛋白表达系统在生物制药技术中的应用。 一、重组蛋白表达系统的概述 重组蛋白表达系统是一种基于基因工程技术的方法，通过将外源基因导入至宿 主细胞中，利用宿主细胞的生物合成机制来制造具有特定功能的蛋白质。这些蛋白质可以是药物、生长因子或其他对人类健康有益的蛋白质。常见的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。 二、重组蛋白表达系统的优势 重组蛋白表达系统具有以下几个优势： 1. 可大规模制备：通过重组蛋白表达系统，可以扩大生产规模，实现大量制备 具有特定功能的蛋白质，满足药物的需求。 2. 高纯度：重组蛋白表达系统制备的蛋白质通常具有高纯度，不含有其他杂质，保证了药物的质量和安全性。 3. 高效率：利用重组蛋白表达系统可以高效地生产目标蛋白质，提高制备效率，缩短制备时间。 4. 确定性：利用重组蛋白表达系统，可以通过控制基因导入和宿主细胞的生长 环境，确保蛋白质的组成和结构，提高产品的稳定性和一致性。

三、重组蛋白表达系统在生物制药技术中的应用 1. 重组蛋白药物的制备：重组蛋白表达系统在生物制药技术中最显著的应用就是制备重组蛋白药物。通过将目标基因导入至宿主细胞中，利用宿主细胞的合成机制，使得大量重组蛋白得以制备。这些重组蛋白药物可以用于治疗癌症、糖尿病、免疫系统疾病等多种疾病。 2. 抗体制备：重组蛋白表达系统还可以用于制备抗体。抗体是一种重要的生物药物，可以用于免疫治疗、肿瘤治疗等。通过将抗体基因导入合适的表达系统中，可以制备出高效、高活性的抗体，为抗体治疗提供了可靠的技术支持。 3. 生物标志物的研究：重组蛋白表达系统可以用于制备一些具有特定功能的生物标志物。生物标志物是人体内部生理或病理状态的指示物质，对于临床诊断和治疗具有重要意义。通过制备重组蛋白表达系统产生的生物标志物，可以更好地进行疾病的诊断和监测。 4. 基因工程草药的研究：重组蛋白表达系统还可以用于研究基因工程草药。基因工程草药是指通过基因工程技术将具有特定功能的基因导入至植物中，使其具有特殊的药用价值。重组蛋白表达系统可以帮助实现对草药的基因改造，提高草药的产量和药效，为草药的研究和开发提供新的手段。 四、重组蛋白表达系统的发展趋势 随着近年来生物制药技术的不断发展和进步，重组蛋白表达系统也在不断优化和创新中。未来，重组蛋白表达系统有望继续发展，呈现以下几个趋势： 1. 提高表达效率：未来的重组蛋白表达系统将更加注重提高表达效率，使得更多的蛋白质可以通过这种技术得到制备。 2. 扩大宿主范围：目前，重组蛋白表达系统主要使用大肠杆菌、酵母菌等微生物作为宿主细胞，未来有望扩大宿主范围，使得更多种类的宿主细胞可以用于重组蛋白的表达。

原核表达系统的工作原理

原核表达系统的工作原理 原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。 1. 原核表达系统的基本构成 原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。 表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分： （1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。 （2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。 （3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。 （4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。 宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。 2. 原核表达系统的工作流程 原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达： （1）制备表达载体 将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。 （2）转化宿主细胞 将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。 （3）表达基因转录和翻译 转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。 （4）目标蛋白质的后处理和纯化

将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。通常采用离心、过滤或柱 层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。 3. 原核表达系统的优缺点 原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。 （1）优点 ①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。 ②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。 ③成本低：与哺乳动物表达系统相比，原核表达系统的成本更低，适合大量生产需 求。 （2）缺点 ①不能表达复杂蛋白：原核生物不能进行糖基化、磷酸化等修饰，因此不能表达复杂 蛋白质。 ②蛋白质结构不稳定：由于缺乏复杂的后翻译修饰过程，原核表达系统所产生的蛋白 质结构往往不稳定，易于降解和失活。 ③易产生内源蛋白质：原核表达系统中往往会产生大量内源蛋白质，需要进行清除才 能得到目标蛋白质。 4. 小结 原核表达系统是一种重要的生物技术工具，其能够高效、简便、低成本地表达目标蛋 白质。在选择表达系统时，需要根据要表达的蛋白质的复杂性和翻译后需要的后修饰水平，综合考虑选择最适合的表达系统。 原核表达系统还常用于筛选抗原、生产药用蛋白和工业酶、研发新药物等方面。利用 原核表达系统表达细胞毒素、重组蛋白等抗原，可以用于制备疫苗和诊断试剂；利用原核 表达系统表达生长激素、胰岛素等药用蛋白，可以用于治疗疾病；利用原核表达系统表达 葡萄糖异构酶、纤维素酶等工业酶，可以用于生产生物燃料、饲料和化学品等。 在原核表达系统的应用中，需要注意表达载体的构建和宿主细胞的选择。一般来说， 表达载体应该具备高复制数、稳定性、容易扩增等特点，同时这些特点还需要与宿主细胞 相匹配。而宿主细胞则应该具备易于转化、高表达量、低内源蛋白质含量等特点。 原核表达系统在应用过程中还需要解决一些技术难题，如纯化目标蛋白质、提高目标 蛋白质的稳定性和活性等。在实际应用中，需要结合实验者的技术经验和特定问题进行具 体优化处理，以获得最佳表达和生产效果。