真核表达系统
真核表达系统
原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势
1.具转录后加工系统；
2.具翻译后修饰系统；
3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：
(一)、基因结构特点：
1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)
克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生
物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。
因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。
5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真
核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。
(1)甲基化帽(methylated cap)——甲基鸟嘌呤核苷酸帽
(m7’G)
真核生物mRNA 5’端除加一m7Gppp外，其后面的第一个核苷酸的2’-OH也甲基化。帽的功能：有效封锁RNA 5’结尾以防降解。提供核糖体识别位点，促使核糖体与mRNA 的结合。
(2)3’结尾的Poly A(100~200个核苷酸)：使mRNA3’结
尾稳固，不受酶破坏，并可促使mRNA转运至细胞质中。
6.含大量重复序列：
(1)编码功能重大，需要量多的产物，eg.组蛋白。
(2)参与基因调剂：结尾反向重复序列，形成基环结构
(3)与染色体构象、着丝点形成有关。
7.没有操纵子结构：真核向往功能相关基因并非老是排列在一
路，而是大多分散在不同CS上，即便空间位置相近，也是别离进行转录。
(二)、表达调控特点：
1.多层次、多方面：DNA-组蛋白的高级结构 DNA转录—加工—
切除—运输—翻译。
2.形成单顺反子mRNA：即每一条mRNA只能给一种蛋白质编码
(图)。
3.转录与翻译在时刻、空间上分开独立进行。
(三)、调控模式：多层次
1.转录前水平(基因组水平)：基因结构上的改变、稳固持久、不
可逆
(1)基因突变：细胞癌基因突变→转化。Eg.大多数肿瘤
中都发觉有ras 基因的突变：12Pro、16Pro突变→p21蛋白
功能改变→细胞转化。
(2)基因重排：某些基因片段改变原先的顺序而从头排
列。基因重排不仅单指空间结构上的改变，还常伴有基
因片段的丢失和扩增。Ig产生即是基因重排的代表。
(3)甲基化：真核向往在启动子周围有一CG区，其中C
可发生甲基化(5’mCG)而抑制基因表达。Eg. p16是一种
新型抑癌基因，在70%以上的肿瘤细胞中有缺失/突变，
现发觉p16的功能异样很多是由于其5’端CG甲基化造成
的。
另外基因扩增及染色体结构改变(组蛋白与DNA的解离/
聚合，染色体的空间构型)都可致使基因表达的转变。2.转录水平调控：基因调控的重要一步要紧涉及三种因素
(1)RNA聚合酶：真核生物有三种，RNA聚合酶Ⅱ→mRNA,调
剂其活性→表达水平。
(2)顺式调控因子(cis-acting factor)：与结构基因串联的
特定DNA序列，对基因转录的精准起始和转录活性有重要意义，要紧包括；
①启动子(promoter)：5’端与转录起始有关的DNA序列。
近距离起作用(100bp)，有方向性，空间位置恒定，包括：一般启动子元件TATA-box(Hogness box):TATAAAA或TATATAT, 30区。决定基因转录的精准起始，活体中缺失后
虽可转录但无精准起始点。即TAT box保证精准起始点，并
对转录水平有定量效应。
上游启动子元件(ups):协同假定转录的基础效率，包括：CAAT盒：GCT(C)CAATCT：-70~-80bp区域，RNA聚合酶
结合部位，RNA聚合酶Ⅱ可识别此保守区；GC盒：CCGCCC，位置不定，多拷贝，位于CAAT双侧，可能与增强转录起始
效率有关。
决定基因的特异性表达：
组织特异性元件：eg. 肝细胞中的HP1,位于白蛋白，AFP等
的调控区。
诱导性启动子元件：cAMP反映元件(CAE)：介导对cAMP生
长因子的反映。
②增强子(enhancer):
本身不具有启动子活性，但可增进基因转录活性的顺式调控元件，
核心顺序：TGGAAG，是真核基因高效转录所必需。
无方向性，可在基因上、下游的任一名置发挥作用，插入方向能够是3’→5’，也能够是5’→3’，均有活性。
远距离作用(几十kb处也可)
无基因特异性，故可分离某一基因的增强子人为插入靶基因的周围，达到提高转录效率的目的。
具组织特异性和相位性 enhancer是真核基因工程顶用来提高转录效率从而提高表达效率的重要手腕，eg. SV40的增强子，Ig 基因增强子(位于RF，C之间)
③寂静子(silencer)/衰减子(dehancer):抑制基因转录的
顺式调控元件
④加尾信号及转录终止信号
·Poly A加尾信号：AATAA位于Poly A上游10~20bp处
·Poly A尾的终止信号是G/T簇
·无Poly A尾的基因其转录终止信号是一段能形成发荚结
构的反向重复序列。
(3)反式作用因子(trans-acting factor):由位于不同或相
同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺
式调控元件和RNA聚合酶的彼此作用而调剂基因转录活性。
①顺式作用元件是反式作用因子的结合位点，并通过反式
作用因子的作用实现顺式调控元件调控基因转录的作
用。
②结构上包括
DNA结合的结构域—与特定DNA顺序结合
DNA活化的结构域—调剂基因表达
故反式作用因子言可称为DNA结合蛋白。
③依照作用方式可分为三种：
一般转录因子，多数细胞中普遍存在，可与TAA盒，GC 盒等一般启动元件结合。
组织特异性转录因子：仅在某种细胞中表达，并特异性识别组织特异性启动元件，发挥作用，是基因表达组织特
异性的决定因素，eg. OCT-2仅在淋巴细胞中表达，并识别
Ig基因启动子和增强子，OCT-2是Ig特异性表达的决定因
素。
诱导性反式作用因子：其活性可被特异的诱导因子诱导，eg cAMP结合转录因子可被cAMP诱导。
3.转录后修饰
(1)戴帽加尾(增加稳固性)
(2)剪切去除内含子：剪切方式多样，并非是所有外显子都
选择，通过选择剪切能够调剂基因表达；
①通过对内含子的去舍决定基因转录的开关，或对5’3’
非编码顺序的选择剪接，决定转录效率。
②通过对外显子的选择，产生不同功能的蛋白质；
③通过对3’结尾特殊序列的选择，产生不同定位的蛋白
质：B细胞在转录形成IgM时，假设选择3’端的一段编
码疏水性膜结合片段的外显子，那么可产生分泌型IgM。
4.翻译水平的调控：涉及参与翻译进程中的各因素，如mRNA稳固
性，tRNA的多少、功能，可溶性蛋白因子的修饰(肽链起始因
子延伸因子等)，反义RNA是参与翻译水平调控的重要因素：(1)反义RNA(anti-sense RNA):一段含有与被调控基因产生
的mRNA互补的碱基序列的小分子RNA。
(2)反义RNA可与mRNA结合，形成双链结构，从而阻碍mRNA
的翻译，最初发觉于原核(1981年美国NIH发觉中的无心义链转录形成一段小片段，即)反义RNA，1984年提出反义RNA 的概念)。
①反义RNA可与mRNA5’帽结合，阻碍mRNA与核糖体的结
合，缩短mRNA寿命
②反义RNA与外显子、内含子连接部位结合，阻碍剪切。
③反义RNA与Poly A结合，阻碍转运。
反义RNA结合部位：m7G…5’非编码序列…
↑核糖体结合部位AUG…外显子…内含子…3’非编码区…Poly A
↑↑
(3)反义技术：人工合成一段反义RNA/DNA，对基因表达进
行调控
①人工合成一段反义RNA/DNA，也可分离无心义链转录形成
②构建反义RNA/DNA载体，导入受体细胞，或仅将反义RNA
注入受体
③应用：对病毒、癌基因的翻译进行阻断，有可能成为一
种只损伤病毒，而不阻碍其他细胞的有效方式，eg. HBx
基因可能是HBV致癌的重要缘故。
反义分子种类：反义DNA、反义RNA
核酶(中心序列＋侧翼序列)
↑↑
剪切功能结合功能
多靶位核酶
反义技术三步曲：①人工合成(修饰/不修饰②基因导入③核酶
反义技术之应用：①抗病毒②抗肿瘤③人工免疫：导入目的基因的反义RNA
5.翻译后水平调控
切除信号肽，进行磷酸化，乙酰化、糖基化等化学修饰，最终形成具有天然空间构型的有功能蛋白。
三、真核生物的基因克隆
(一)目的基因的取得：
1.鸟枪法：提取细胞总DNA—非特异性切割(机械剪切，eg超声；
Ⅱ型酶酶切)—成立基因库—挑选(以目的基因为探针进行杂交)
优势：与天然状态相似
缺点：操作复杂，机率低，含内含子和它非编码序列。
2.化学合成法：小分子肽，可直接合成并可同时进行改造，
3.反转录合成cDNA:最经常使用，选取目的mRNA丰度高的细胞抽
提总RNA→挑选mRNA(细dT寡核苷酸探针杂交或过柱纯化)→反转录合成CDNA→建库→以目的基因为探针挑选。
4.PCR扩增特定片段：以PCR方式直接从DNA上扩增目的片段或
抽提mRNA,进行RT-PCR：先反转录出cDNA,再PCR相应片段，省略了复杂的建库工作。
(二)、克隆和挑选
即将目的基因通过体外重组的方式插入载体中，并经挑选取得目的基因的克隆的进程。所需的载体为克隆载体。
1.克隆载体：即能够将外源基因导入受体细胞，并着其中复制、增殖，从而取得大量目的基因片段的载体。
据受体细胞的不同克隆载体能够分为：
(1)原核克隆载体：带有原核复制起始点，能够在原核细胞中
复制、增殖的载体，eg pBR322，pUC系列等。
(2)真核克隆表达载体：带有真核复制起始点，可在真核细胞
中复制、增殖。因为真核细胞体外培育技术要求高，周期
长，费用高，故很少用真核细胞扩直到目的基因，一样关
于真核基因多是先借助原核克隆重体在原核细胞中克隆
扩增，然后再构建真核表达载体进入真核细胞表达。
1.克隆：即体外重组的进程，即将载体与外源DNA在体
外酶促连接，经常使用的连接方式有：
(1)平结尾连接：
(2)粘结尾连接：注意因载体自身环化和反向插入造成的假阳
性重组子，可作定向克隆(图)
(3)同聚物接尾法
(4)人工接头法：假设外源基因片段和载体没有一起酶切点，
能够在外应基因两头加上一个含相应酶切点的人工接头
(图)
4.挑选：利用原核细胞进行克隆的挑选，见前述。
假设利用真核载体在真核细胞中进行克隆，因为真核细胞中没有特殊标志，故应在真核载体中加入标志基因，下面介绍几种经常使用的真核标志基因:
(1)胸腺激酶(tk)基因：细胞中：
二氢叶酸还原酶
二氢叶酸——————→四氢叶酸—→dTTP、dCTP、dATP
↑阻断
培育基中加入氨基喋呤(A)
tk
正常细胞中有tk基因：胸苷(T)→胸苷-磷酸→dTTP
假设同时补加次黄嘌呤(H)→dCTP、dATP 细胞存活
tk－细胞无tk基因→不成活
故在含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸苷(T)的HAT选择，培育基中只有tk+细胞成活，假设以tk－为受体，载体中加入tk基因，那么阳性重组子可在HAT中成活。
(2)二氢叶酸还原酶(dhfr)基因：
dhfr-细胞无法在一般培育基中成活，而带有dhfr的阳性重组子那么能够生存。以dhfr-细胞为受体
(3)新霉素抗性基因(neo):
新霉素可杀死原核生物，对真核细胞无毒；而新霉素的类似物G418却同时对原核、真核均有毒，故一样真核生物在含G418的培育基中不成活，neo编码的酶可使G418灭活，故neo+细胞可在G418中生存。此种挑选方式对受体细胞无要求，应用更简便。
四、真核载体
真核载体：可将外源基因导入真核细胞，并在其中复制、增殖、表达的载体
真核克隆载体：适用于在真核细胞中复制、增殖、扩增外应基因的载体。
真核表达载体：适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体依照受体不同，又可分为几种：
(一)、酵母系统载体
酵母是一种低等的单细胞真核生物，能够像细菌一样在简单培育基上快速增殖，故而同时具有快速、高效表达基因和真核修饰系统，用作酵母载体受体的多为酿酒酵母。
1．特点：
(1)遗传标记：酵母虽可表达抗生素，但却对抗生素不灵敏，故
不能以抗生素为标志基因。
用作酵母载体的遗传标记是一些特殊的功能基因(表)
(2)穿梭载体(shuttle vector):
同时含有原核复制起始信号，挑选标志和展现会核复制信号及真核表达调控元件的重体，这种载体既能够这原核细胞中复制增殖，又能够在真核细胞中复制表达外源基因。
(3)用于酵母载体中的调控序列：(自主复制序列Autonomously
replicating sequences)
①ARS：酵母复制起始区(点)
②2μM质粒(酵母游离基因)：正常存在于酵母核质中的小的
环状DNA(电镜下为2μM大小)，类似于细菌质粒，能够独
立复制并转录。
③酵母启动子：被酵母RNA聚合酶识别，启动真核基因在酵母
中的表达，经常使用的有ADH1(醇脱氢酶)、SUC(蔗糖酶)、
PGK(磷酸甘油激酶)、Apase(碱性磷酸酶)启动子。
④酵母着丝粒区段(cEN)：增加转化子稳固性
2.种类：(表P59)图
(1)表达载体：含PGK启动子
(2)酵母人工染色体(YAC)：1983年成立
组成：酵母染色体和2μM复制起始区
着丝粒DNA、膜虫端粒DNA
特点：容量大：300kb~1000kb
稳固性好：在有丝割裂和减数割裂时维持稳固性，不至
丢失、断裂、重排
应用：构建基因组文库。通常构建基因组文库的载体为λ噬菌体和粘粒，它们的容量都极有限(＜46kb 而一些真核基因较大(几百~几千kb)，不能完整插入上述载体，且用噬菌体和粘粒建文库工作量极大，YAC可克服上述缺点，可能成为分离研究大基因片段和成立基因文库的良好载体。已有报导各国学者试图以它成立人的基因组的物理图谱。人基因组大约3×106kb，随机切割为200kb~2000kb的片段并克隆入YAC，在巴黎已取得225个克隆，约占人基因组的75%,现正在用各类方式进行排序。
3.优、缺点：
优势：酵母被称作真核中的大肠杆菌，也利用它成功表达了人干扰素、HBsAg
缺点：具厚壁，转化困难
转化率低
转化子稳固性差
某些带内含子的真核基因，不能有效表达(对酵母CS了解不全。
(二)、动物病毒载体
动物病毒可在动物细胞中形成较高的拷贝数，并具壮大启动子，是哺乳动物细胞中的理想载体
1.颗粒型病毒载体：外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基
因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制。
2.载体条件：
病毒具有复制非必需区，可供外源基因插入或取代
——多需辅助病毒帮忙包装
平安、易培育、宿主范围广
(1)SV40(猴肾病毒)载体
·SV40基因组较小,其基因结构已清楚
·基因组结构初期区：溶源生长所必需
晚期区：产生病毒衣壳蛋白，包装病毒颗粒
所必需
复制起始位点：早、晚期之间
·载体构建：初期取代晚期取代
·天然SV40经历代构建的载体宿主范围窄，容量小易形成野生型V，故较少应用，而是利用其调控元件。
(3)反转录病毒卸甲载体(disarmed vector)
·基因组结构：ssRNA
·载体构建：之外源基因历代原病毒双链DNA中的癌基因
·优势：宿主范围广、较大容量(7~8kb)、以转染方式主动感染宿主细胞，且以原病毒形成长期稳固存在
·缺点：平安性差(改建为穿梭载体)
(3)痘苗病毒：容量大，平安性好(长期用作预防天花的疫苗)，
可用来构建多价疫苗。
(4)腺病毒载体：
·基因结构：dsDNA,线性，36kb
·载体构建：取代结构基因
·优势：平安性高(人为自然宿主)、滴度高、无包膜，不易被补体灭活，可直接体内应用，作为基因医治的载体，已用于临床。
·缺点：基因组大，操作复杂，不能整合，只能短暂表达，需重复应用，易引发免疫反映，无靶向性
2．混合型病毒载体：由病毒复制信号、转录单位及质粒片段和选择标志基因组成，目前所用病毒载体，多为汉化型(穿梭载体)，因较为方便，易改建，而少用颗粒型载体。
(1)SV40 DNA元件组成的穿梭载体——pSVK3
(2)反转录病毒穿梭载体
·构建：将RV病毒的LTR中复制起始区和选择标志插入pBR322,即为shutter vector(可在原核中复制，在真核中表达)
·包装细胞：RV的穿梭载体及结构基因被取代的颗粒型RV载体因缺失结构基因，而不能被包装形成完整病毒粒子，不能感染宿主细胞，故需要包装细胞解决这一问题。
包装细胞：被辅助病毒感染的细胞，这种细胞产生包装蛋白，因自身缺乏包装信号不能包装，但可给载体提供包装蛋白而完成病毒包装，产生具感染力的活的病毒粒子。
辅助病毒：缺失包装信号的反转录病毒。
·进程：RV载体导入包装细胞后，一起作用完成病毒的包装，形成具感染力的重组RV，重组RV感染宿主后，因宿主细胞缺
乏包装蛋白，不能产生病毒颗粒，避免病毒的扩散(平安性高)
外源基因
↓克隆转染
RV穿梭载体————→包装细胞系
↓↓
E．coli 重组RV
↓↓感染(转染)
复制扩增受体
↓
表达蛋白
·包装细胞的进展
Ψ2：最初的包装细胞(第一代)，仅缺失包装信号，而具有完整的整合和反转录信号，导入的RV载体与包装细胞中的辅助病毒很容易重组产生野生型病毒，而且重组RV进入受体细胞，受体细胞中的内应序列也有可能修复重组RV产生具感染力的病毒粒子。
PA317：第一代包装细胞，缺失包装信号外，同时缺失5’LTR 的5’结尾，病毒的整合位点，并将病毒复制起始点和3’LTR以SV40的Poly A位点取代减少重组产生野生型病毒可能性。
ΨCRE/ΨCRIP：(第三代)，在第二代的基础上，将gag/pot DNA 片段与env DNA片段分离，并引入突变与缺失。
(三)、昆虫杆状病毒载体
昆虫杆状病毒是许多农林业昆虫的天敌，对人无寄生能力，
平安性高。
1.基因组特点：
①Baculivirus基因组庞大
②具复制非必需区，可用于改造基因工程载体
经常使用的杆状病毒复制非必需区有：
(a)多角体蛋白编码序列，启动子启动能力强，编码多角
体
(b)P10蛋白序列
杆状病毒基因工程开始于1983年，Smith第一次表达IFN-γ成功，至今已表达各类外源基因几百种，其中有拟用
于预防AIDS的基因工程疫苗。国内从80年代中、末期开始
此项工作，至90年代初已用它表达了HBs、IFN-γ，α等
各类基因(武汉、广州)，此刻国内的此项工作已从南到北，目前，北京、浙江都有许多实验室做。
2.构建流程
杆状病毒基因组庞大，体外基因操作困难，故需要转移载体帮忙。
转移载体(transfer vector):同时含有原核序列(复制起始信号、抗性基因)和病毒基因组序列的载体,除可携带外源基因在原核中复制、扩增外，还可通过细胞内同源重组，将外源基因插入病毒基因组，构建重组病毒。当转移载体与病毒DNA共转染至同一细胞时，二者发生同源重组，外源基因取代病毒复制非必需
区，形成含外源基因的重组病毒。
3.杆状病毒载体的优势：
(1)容量大
(2)具强启动子
(3)具有易识标志
(4)具有良好后修饰
(5)平安性高
五、克隆基因在真核细胞中的表达
(一)、在酵母中表达外源基因
酵母细胞
↓去除细胞厚壁
原生质球←——————构建穿梭质粒
扩增↑↓转化
表达蛋白
(二)、在哺乳动物中的表达
1.构建表达载体(P65)
2.转染：病毒DNA/RNA导入细胞的方式
磷酸钙沉淀法：磷酸缓冲液(含DNA)
CaCl2 数hr→换液→培育
对数生长期细胞
(三)、在昆虫细胞中的表达
1.构建转染载体
2.共转染
3.重组病毒挑选
4.表达
六、基因医治
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母表达系统 点击认领 巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。 编辑摘要 巴斯德毕赤酵母表达系统 - 简介 十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。 巴斯德毕赤酵母表达系统 - 毕赤酵母表达系统的特点 自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统 常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。 1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。 2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。 3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。 哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。常用质粒表达载体如pcMVp-NEO-BAN、pEGFP 等，都以pCMV启动子驱动外源真核蛋白高水平地稳定表达，由于载体有Neo 抗性基因，转染细胞后用G418筛选，可建立稳定高效表达的细胞系。哺乳动物细胞表达常用的宿主细胞有COS、CHO、BHK、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质糖基化有不同的影响，因此选择宿主细胞时应根据具体情况而定。根据不同实验目的，蛋白质可以进行瞬时表达、稳定表达或者一定条件下诱导表达。
不同蛋白质表达系统的比较
不同蛋白质表达系统的比较蛋白质是细胞内重要的生物大分子，可以发挥许多生命活动的关键作用。不同的蛋白质表达系统可以用于生产不同类型的蛋白质，比较蛋白质表达系统的优缺点对于选择合适的表达系统具有重要的意义。本文将介绍现有的几种主要的蛋白质表达系统，并对它们的特点进行比较。 第一种蛋白质表达系统是基于真核细胞的表达系统。真核细胞是具有细胞核的细胞，其中包括了动物细胞、植物细胞和真菌细胞等。这种表达系统利用真核细胞的转录和翻译机制来制造目标蛋白质。在这种系统中，目标基因被插入到真核细胞的基因组中，然后通过RNA剪切和mRNA成熟等机制生成成熟mRNA，从而进行翻译，最终目标蛋白质被产生出来。 真核细胞表达系统的优点包括：能够产生生物活性和功能齐全的蛋白质。这种系统还适用于产生大量的蛋白质，因此被广泛应用于产生多肽、抗体等药物。但是，真核细胞表达系统的劣势在于工艺更加复杂，容易出现蛋白质不稳定、失去生物活性的问题。此外，该工艺需要一定的时间来建立并优化系统。 第二个系统是基于细菌的表达系统。细菌是单细胞生物，具有非常简单的结构和进化历史，是蛋白质表达方面的主要模型。在这种表达系统中，表达载体中的目标基因被转化为蛋白质，并通过重组不同的DNA序列来实现该过程。这种系统的优点在于简单、实时、具有可伸缩性和高效性。制备蛋白质的成本也相对较低。
然而，这种表达系统的制约因素也很明显。细菌系统不能表达合成二硫键、表达动力多肽等蛋白质的功能，使其应用领域相对狭窄。此外，细胞酸碱值和产生蛋白质的环境等因素，都是影响蛋白质表达的关键因素。 第三种蛋白质表达方式是基于哺乳动物细胞的表达系统。哺乳动物细胞表达系统主要用于大规模制备人用蛋白质。这种表达系统利用哺乳动物细胞的转录和翻译机制来制造目标蛋白质。在这种系统中，目标基因经过一系列的转染和筛选过程，被转移到哺乳动物细胞中，利用细胞所提供的设备进行蛋白质合成和修饰。 哺乳动物表达系统具有高表达量、具备更完整的蛋白质修饰等诸多优点。但其成本较高，而且表达时间也相对较长。 总体来说，不同的蛋白质表达系统之间具有各自明显的优点和局限性。正确选择合适的表达系统需要与目标蛋白质的特征和应用领域相结合，才能发挥最大的作用。
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍 真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。在生 物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。 真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转 化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。 在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白 质药物。植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。 在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。 转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。 一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因 子和调控序列等元件。一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比较
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比 较 蛋白质表达是生物学研究中至关重要的实验技术之一，它可以帮助 科学家们生产大量特定的蛋白质，并且进行进一步的研究。在进行蛋 白质表达时，科学家们可以选择将目标基因表达于原核或真核细胞中。本文将对原核细胞和真核细胞的差异进行比较，分析选择适合的蛋白 质表达系统的几个关键因素。 1. 细胞结构差异 原核细胞是没有真核细胞特有的细胞核和复杂的胞器结构的单细胞 有核生物。相比之下，真核细胞的细胞结构更加复杂，包括细胞核、 线粒体、内质网等。这些细胞器的存在使得真核细胞在蛋白质表达过 程中能够进行更多的后续修饰和折叠，从而获得更高的蛋白质表达效率。 2. 转录与翻译差异 在原核细胞中，DNA转录和蛋白质合成是同时进行的。因为没有 细胞核的隔离作用，转录和翻译可以在细胞质中同时进行。而在真核 细胞中，DNA转录发生在细胞核中，形成的mRNA需要通过核孔复合 体进入细胞质，然后才能进行翻译。这种分离的过程使得真核细胞蛋 白质表达的效率相对较低。 3. 后续修饰能力差异
真核细胞拥有更强大的后续修饰能力。在蛋白质合成过程中，真核细胞能够进行糖基化、磷酸化、酰化等修饰作用，从而赋予蛋白质更多的功能和稳定性。相比之下，原核细胞的后续修饰能力较弱，只能进行有限的修饰。 4. 表达量与成本差异 原核细胞的表达系统通常能够提供较高的表达量，因为它们能够在较短的时间内合成大量的蛋白质。此外，原核细胞的培养成本相对较低，适用于大规模生产。真核细胞在表达大蛋白质时效率较低，而且培养成本相对较高。 综上所述，选择表达系统需要考虑具体实验要求。如果需要大量表达，可以选择原核细胞，如大肠杆菌。原核细胞表达系统的优势在于高表达量和低成本。而如果需要进行复杂的后续修饰，以及模拟真实细胞环境的蛋白质表达，则可以选择真核细胞，如酵母或哺乳动物细胞。真核细胞表达系统的优势在于能够进行复杂的蛋白质修饰和得到更接近自然状态的蛋白质。此外，还可以根据实验需求进一步优化表达系统，例如引入特定的启动子或基因调控元件来提高表达效率和稳定性。 在选择蛋白质表达系统时，重要的是综合考虑目标蛋白质的性质和实验要求。只有根据具体情况选择合适的细胞类型和表达系统，才能取得更好的实验结果，并在科学研究中发挥更大的作用。
真核表达系统
真核表达系统 原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。 一、优势 1.具转录后加工系统； 2.具翻译后修饰系统； 3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。 二、真核基因结构及表达调控特点： (一)、基因结构特点： 1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)
克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。 2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生 物转录、翻译不可能持续进行。 3.不持续性：内含子、外显子。 内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。 4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。 因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。 5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真 核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。
蛋白质表达与纯化技术进展
蛋白质表达与纯化技术进展 蛋白质表达和纯化技术是现代生命科学领域的重要研究方向之一。蛋白质是生物体的重要组成部分，它们在细胞内发挥多种重 要的功能，如催化代谢反应、维持细胞结构和信号传递等。因此，研究蛋白质的结构和功能对于深入理解生命现象和开发新药物具 有重要意义。 在过去的几十年中，蛋白质表达和纯化技术得到了迅猛发展。 这些技术的主要目的是在大量表达和纯化蛋白质的同时保持其结 构和功能的完整性。下面将介绍一些主要的蛋白质表达和纯化技 术进展。 一、蛋白质表达技术 1. 原核表达系统 原核表达系统是最早被开发出来的蛋白质表达系统之一。该系 统利用了细菌的表达机制来表达目的蛋白质。原核表达系统主要 包括大肠杆菌表达系统和蓝藻表达系统。这两个系统具有表达效
率高、操作简便等优点。同时，这些系统也存在着一些问题，如 无法表达复杂的蛋白质、蛋白质折叠和结构的失真等。 2. 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母表达系统是一种简单易用的真核表达系统，被广泛应 用于蛋白质的高效表达。与其他真核表达系统相比，酿酒酵母表 达系统具有表达效率高、生长速度快等优点。由于酿酒酵母表达 系统是一种酵母菌，因此其表达的蛋白质具有真核生物的折叠和 修饰机制，表达的蛋白质可以更好的保持其原始性和功能性。 3. 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是一种常见的真核表达系统，它利用了昆虫 细胞的表达机制来表达目的蛋白质。与其他真核表达系统相比， 昆虫细胞表达系统具有表达效率高、蛋白质修饰机制完整等优点。由于昆虫细胞表达的蛋白质具有真核生物的修饰机制，因此该系 统被广泛应用于研究真核生物的蛋白质结构和功能。 二、蛋白质纯化技术
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统 及其优缺点 蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白 质来研究其结构和功能。蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。本文将对这两种蛋白质 表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。 一、原核表达系统 原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的 系统。该系统具有以下特点： 1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平 的优势。通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量 的外源蛋白质。 2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。 3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天， 速度较快。这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。 然而，原核表达系统也存在一些缺点： 1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复 杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻 译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。 3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达 系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。 二、真核表达系统 真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。真核表达系统具有以下特点： 1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。 2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类 蛋白质。 3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达， 适用于工业化生产。 然而，真核表达系统也存在一些缺点： 1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。 2. 更复杂的培养条件：真核生物细胞需要复杂的培养条件，包括特 定的培养基、培养温度和培养时间等。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞，表达载体 1、pCMVp—NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞
蛋白质的高效表达和纯化技术
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构， 也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。因此，蛋白质的 高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。 蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。原核表达系 统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的 蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过 转化酵母细胞实现表达。大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基 因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行 表达。相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达 速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化 和折叠过程。 真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达 和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺 乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常 会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。而载体的 选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表 达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对 于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和 pEF系列载体。 在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋 白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或 离子浓度来调节分离效果。亲和层析则是通过利用蛋白质与其特 异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离 子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现 分离。而凝胶过滤则是将混合的蛋白质分子在凝胶中进行分子量 筛选。这些方法可以组合使用，构建复合层析方法，来进行高效 的纯化。 此外，现代生物技术还发展了很多新的高效表达和纯化技术， 例如标记蛋白技术、热稳定蛋白技术、分子筛技术等。在标记蛋
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。 3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP—Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明： pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的
蛋白质表达与药物开发的应用研究利用蛋白质表达系统进行药物筛选
蛋白质表达与药物开发的应用研究利用蛋白 质表达系统进行药物筛选 蛋白质表达与药物开发的应用研究 随着生物技术的不断发展，蛋白质表达系统在药物开发中起到了至 关重要的作用。通过利用蛋白质表达系统进行药物筛选，科学家们能 够更加高效地发现潜在的药物靶点并进行开发。本文将介绍蛋白质表 达系统的种类以及在药物开发中的应用研究。 一、蛋白质表达系统的种类 1.原核表达系统 原核表达系统包括大肠杆菌（E.coli）、酵母菌等。其中，E.coli是 最为常用的原核表达系统之一。原核表达系统具有表达效率高、操作 简便等特点，在药物开发领域得到广泛应用。 2.真核表达系统 真核表达系统包括哺乳动物细胞、昆虫细胞等。相比原核表达系统，真核表达系统能够实现对复杂蛋白质的正确折叠和修饰，更贴近天然 情况。但真核表达系统需要较高的成本和复杂的操作步骤。 二、蛋白质表达系统在药物开发中的应用研究 1.蛋白质表达系统的构建
为了高效表达特定蛋白质，科学家们需要构建适合的表达系统。通过对不同表达载体的选择、启动子的设计以及转染技术等手段，可以实现目标蛋白的高效表达。 2.药物靶点的发现 蛋白质表达系统可以帮助科学家们发现新的药物靶点。通过大规模筛选蛋白质库，可以发现与特定疾病相关的蛋白质分子，为研发新药提供候选靶点。 3.药物活性的评价 利用蛋白质表达系统可以对药物的活性进行评价。通过与特定蛋白质相互作用，可以研究药物的结合方式、亲和力等特性，为药物设计与开发提供重要线索。 4.药物的副作用研究 在药物开发过程中，评估药物的副作用是非常重要的一环。蛋白质表达系统可以模拟人体内蛋白质的表达情况，通过研究药物对不同蛋白质的影响，可以预测药物的副作用。 5.新药的制备 蛋白质表达系统在新药制备方面发挥着重要的作用。通过对目标蛋白进行大规模表达和纯化，可实现药物的批量制备，为进一步临床研究提供足够的药物样品。 三、蛋白质表达系统的优势与挑战
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化 蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA 的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，
真核细胞表达系统
之南宫帮珍创作 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采取进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产品，而且所需的成底细对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞发生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产品纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产品的生物活性较低。 为克服上述缺乏，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA 与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活
或抑制； ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及； ③能严格调控基因表达，即不但可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中经常使用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1、酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在该基因的启动子(PAXOI)作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli／Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起