辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展
第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407
辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的
应用研究进展
周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚
(生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122)
摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三
关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料
中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一
Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials
ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang
(Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial
收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12
基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费
专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021)
第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三
通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.wendangku.net/doc/8a16438621.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料
对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝
改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很
PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使用手册
1PH0728|DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 Catalog No ：PH0728 Size ：?100mL Storage ：Store@-20℃避光保存 ◆产品简介DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA 等膜显色的试剂盒。 DAB 即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB 会产生棕色沉淀。该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB 显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 ◆试剂组分 试剂(A):DAB 显色液A---50mL (-20℃避光) 试剂(B):DAB 显色液B---50mL (-20℃避光) 试剂(C):DAB 显色液C---100uL (RT) 自备材料： 1、洗涤液 2、蒸馏水◆使用参考 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 ◆注意事项 1、DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ◆常见问题 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 ④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。 2、没有显色或显色太弱 ①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。 ②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 ③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。
辣根过氧化物酶制作过程
过氧化物酶体与溶酶体不同，过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体，因此它不属于内膜 系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细 胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。过氧化 物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2，Hydrogen Peroxide）水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。 HRP的制备 ⒈水提取： 称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在 搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次， 合并两次滤液，量总体积和度，0。 ⒉硫酸铵分级分离： 在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2 小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度） 随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离 心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸 馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析 1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成 用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。 将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。 ⒊丙酮分级分离： 将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃ 的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。 ⒋精制： 将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。
PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题
PH0728|DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit Catalog No：PH0728Size：?2×50mL|?2×100mL Store at-20℃ DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。 DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 组分 Component2×50mL2×100mL Storage DAB显色液A50mL100mL-20℃避光 DAB显色液B50mL100mL-20℃ 使用参考 1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 2.按照1:1的比例将显色液A、B液混匀，混匀后即配制成DAB染色工作液。 3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。 4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。 注意事项 DAB对人体有害，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒
DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 简介： DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western 、Southern 、Northern 、EMSA 等膜显色的试剂盒。DAB 即3,3N-Diaminobenzidine T ertrahydrochloride, 是辣根过氧化物酶的常用底物。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合, 即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 注意事项： 1、 DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、 试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 编号 名称 PW0072 2×50ml Storage 试剂(A): DAB 显色液A 50ml -20℃ 避光 试剂(B): DAB 显色液B 50ml -20℃ 避光 试剂(C): DAB 显色液C 100ul RT 使用说明书 1份
辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展
第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407 辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的 应用研究进展 周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚 (生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122) 摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三 关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料 中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一 Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang (Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial 收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12 基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费 专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021) 第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三 通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.wendangku.net/doc/8a16438621.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料 对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝 改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很
辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶（HRP） 一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。 简介： 过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。 用途： 1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B . 2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。 3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。 4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。 实验原理： 过氧化物酶催化以下反应： 2 H2O2 ─→ O2+2H2O
酶和底物
酶和底物 酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有β-半乳糖苷酶、尿酶等。 1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm波长有最大吸收峰，故用A403nm与A275nm比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ不变但活力下降。 HRP的底物有可溶性和不溶性两种。 不溶性底物用于酶免疫组化技术： 可溶性底物用于酶免疫测定技术： 2. 碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。 AP不溶性底物： AP可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。 酶标记物的制备
酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。 1. 戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。 ⑴一步法：将2～5mg纯抗体与5mgA P混合于0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液1ml中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用 0.05mol/L pH 8.0 Tris缓冲液透析平衡，即可。 ⑵二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。 2. 过碘酸盐法： ⑴取：HRP 5mg溶于0.2mol／L pH 5.6醋酸盐缓冲液0.5ml中，充分溶解后加入临用前配制的0.1mol／L NaIO4 0.25ml，混匀，于4℃氧化30min（勿超过）。 ⑵加入2.5%乙二醇0.5ml，室温下放置30min终止氧化。 ⑶加入侍标记抗体（γ球蛋白或IgG）或抗原5～10mg，用1.0mol/L pH 9.5 CBS调pH至9.0，混匀。4℃过夜，使HRP与抗体或抗原结合。 ⑷加NaBH4 0.1ml（0.5mg），混匀，4℃2h，使形成的酶结合物稳定。用0.01mol／L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜平衡。 用戊二醛法和过碘酸盐法标记后，应将酶标记物纯化，常用的提纯方法为50%饱和硫酸铵和Sephadex G200(或G150)凝胶过滤。 标记率测定：标记率以A403nm／A280nm比值表示，是HRP的正铁血红素辅基特异吸光度(A403nm)与抗体球蛋白和酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸等的吸光度(A280nm)之比，表示酶标抗体中HRP所占的比例。标记率与HRP／IgG摩尔比（E／P）呈高度正相关。标记率为0.4时，E ／P之比约为1。一般以标记率0.3～0.6为合格。 固相载体 固相载体：最常用聚苯乙烯，载体形状有小试管、小珠和微量反应板。良好的载体应该是吸附性能好、不参与化学反应、能使抗原或抗体保持免疫学活性、空白值低且透明度高。
辣根过氧化物酶直接电化学传感器检测过氧化物的研究
第38卷第3期2019年3月 分析测试学报 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrum ental Analysis) Vol.38 N o.3 345-349 doi: 10. 3969/j.issn.1004 -4957. 2019. 03. 015 辣根过氧化物酶直接电化学传感器检测 过氧化物的研究 曹嫱，杨绍明*，杨杰，张小荣，柏朝朋，滕澈 (华东交通大学材料学院，江西南昌330013) 摘要：该文以高比表面积的泡沫镍电极（N f o m)为基础，通过电沉积碳纳米管（CNT S)制备了C N T s/N i f o m。然后在十六烧基三甲基溴化铵（C T A B)的辅助下，通过一步法电沉积纳米金（A u N P s)将辣根过氧化物 酶（H R P)固定到电极表面，制备了H R P-A u N P s/C N T s/N i f o m直接电化学酶传感器。并采用SEM、能谱 (E D S)和电化学方法对该电极进行了表征，优化了测试电位和p H值，将该传感器对过氧化氢及2种有机过 氧化物进行了检测。结果表明，该传感器性能良好，对过氧化氢、过氧化氢异丙苯、2-过氧化丁酮具有良好 的催化检测性能，其检出限分别为1.2X10—7、4.5X10—7、2.5x l0_7m〇l/L。 关键词：过氧化物；辣根酶；碳纳米管；传感器 中图分类号：0657.1文献标识码：A文章编号：1004 -4957(2019)03-0345-05 R e s e a r c h o n D e t e c t i o n of P e r o x i d e s w i t h H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e Direct E l e c t r o c h e m i c a l S e n s o r C A O Q i a n g，Y A N G S h a o-ming*，Y A N G J i e，Z H A N G Xiao-rong，BAI Chao-peng，T E N G Y u (School o f Materials Science and Engineering，East China Jiaotong U niversity，Nanchang 330013，China) Abstract:Based on the surface of nickel foam electrode(Ni foam)with high specific surface area，a carbon nanotubes(CNTs)/Ni foam was prepared t hrough the electrodeposition of C N help of cetyltrimethylammonium bromide(C T A B)，horseradish peroxidase(H R P)was immobilized onto the surface of CNTs/Ni foam by one - step electrodeposition of A u nanoparticles(A u N P s)，and an H R P - A u NPs/CNTs/Ni foam direct electrochemical enzyme sensor was prepared.S E M，electron dispersive spectroscopy(E D S)and electrochemical methods were adopted to characterize the modified electrode，and the t est conditions for p H value and work potential were also optimized.The sensor was applied in the detection of hydrogen peroxide and two organic peroxides.Re sensor has a good c atalytic detection performance toward hydrogen peroxide，cumene hydroperoxide and 2-butanone peroxide with the d etection limits of 1. 2 X10 7， 4. 5 X10 7and 2. 5 X10 7mol/L， respectively. K e y w o r d s:peroxides；horseradish peroxidase；carbon nanotubes；sensor 过氧化物广泛应用于化工、造纸、医药等领域，对人们的生产生活造成很大影响[1-2]，如过氧化 氢异丙苯溶于水后，不仅污染环境，若被生物体吸入，则会引起中毒，破坏正常的生物机理，阻碍正 常的生物代谢[3]。目前，过氧化物检测的方法主要有分光光度法[4]、化学发光法[5]、荧光法[6]和酶传 感器法[7-8]等，而基于辣根过氧化物酶的电化学传感器法，以灵敏度高、选择性好和仪器设备简单等 优点，受到广大研究者的密切关注。辣根过氧化物酶电化学传感器检测过氧化物一般通过电子介体的 中介作用，或酶的直接电化学法实现酶与电极之间的电子传递。直接电化学法的酶传感器法无需电子 介体，可简化电极制备，但由于酶的电活性中心被蛋白质本体包覆，一般难以实现与电极之间的直接 电化学。因此，纳米材料如碳纳米管[9]、石墨烯[10]、金纳米粒子[11]及复合纳米材料[12]等常被用来修 饰电极表面以促进酶与电极之间的电子传递。如Yagati等[13]先将石墨稀/金纳米粒子复合物修饰到氧 收稿日期：2018-08-14;修回日期：2018 -09-15 基金项目：国家自然科学基金项目（21465012);江西省自然科学基金项目（20171BAB203017) *通讯作者：杨绍明，博士，教授，研究方向：电分析化学及生物传感器，E-m a il: yangsm79@https://www.wendangku.net/doc/8a16438621.html,
DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×)
仅供科研版本号：161208 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×) 【产品组成】 【保存条件】 -20℃,避光,12个月 【产品概述】 DAB辣根过氧化物酶显色液(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。【使用方法】 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):蒸馏水=1:1:18的比例混合,即为DAB染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育30min或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 【常见问题及可能原因】 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。也应请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。 ②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.wendangku.net/doc/8a16438621.html,/ 第1页
辣根过氧化物酶的色原底物
辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2， 2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。 (一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。 在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol ／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。 TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。
辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
HRP 的NaIO4标记法 一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。 Note: 1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。 2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可 被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控 制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有 较高的结合效率。 3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过 碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。 4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。 有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。 二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。 三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）
1.称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮 解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶 解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防 污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于 10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。 2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用 搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。 3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可 先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。 4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。 5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。 6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值 尽量小，大约为总体积的1/20。 7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。 8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。 Note: 在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。 四．待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染） 1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要 求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。 2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。 如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。 （HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP 等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。） 3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时 以上，头两个小时换液一次。 4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半 小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加 到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一 点，反之亦然。） 5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4 （NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。 Note: 拿捏透析袋应戴手套。 五．成品酶的保存： 加等量的甘油，混匀后-20℃保存。 六．附录： 附录1：（标酶过程所用Buffer） TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。 10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：
HRP辣根过氧化物酶标记抗体的方法
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】 来源： 医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关 系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗 体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、 活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧 化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方 法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一)酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP辣根过氧化酶的底物
酶的底物 3.3.1 HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD?2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP 作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温(2～8℃)可稳定1年。 3.3.2AP的底物 AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。 AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。 3.4 洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。 3.5 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 3.6阳性对照品和阴性对照品 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA