辣根过氧化物酶
用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法
辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。
将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。
Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。
至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联
系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。对针刺足三里穴区作胃肠手术或针刺治疗胃肠疾患进行了形态学基础的研究。
一、辣根过氧化物酶的注入问题
注入的浓度及时间：HRP注入法在追溯中枢神经联系和周围神经联系有所不同。中枢神级系统内HRP需要用蒸馏水或生理盐水配成高浓度的溶液, 但也有用pH7.4的磷酸缓冲液做溶剂者[8]。其浓度是30%-50%，注射量是0.05μl-0.1μl, 0.1μl-0.25μl，最大量可以是0.5μl。住射速度很慢, 一般约为0.1μl/10分。Nauta认为可慢至0.05μl/h, 注射后留针15-30分钟。
HRP法在周围神经联系方面, 所用的HRP配制法与中枢相同, 是用蒸馏水或生理盐水配制, 但浓度较低, 1%、5%、10%, Yamamato及Teiji在猫胃壁注入时所用浓度为20%-30%, 注入时间没有说明。而在心脏窦房结及房室注入HRP时浓度为30%-50%。Elfvin在荷兰猪的肠系膜下神经节内注入的浓度25%-30%在5-10min内注入完华。
我们的实验, 是用8-10mgHRP溶于80-100μl的蒸馏水, 浓度是10%注入猫、兔胃壁内, 注入速度是1μl/min, 所得的结果是比较满意的, 经过灌流及孵育等过程, 脊神经节细胞内的HRP酶标颗粒在光学显微镜明视野下, 细胞质内核的周围呈棕黑色颗粒, 暗视野下观察
此棕黑色颗粒则成明亮的小点（参看本期《胃交感内脏传入神经元》的节段性一文附图》。以同样的浓度浸胞足三里穴区的腓深神经断端, 也可以在脊神经节细胞内得到同样的结果。
二、HRP注入后动物的存活时间问题
关于HRP的运输问题, 一般认为是通过神经细胞体与突起末梢间存在着的双向流动的轴浆流axoplasmic flow来运送的。无沦是树突还是轴突都有这种现象[9]。注射部位的HRP被神经末梢及神经终末部分无髓段细轴突以胞饮方式吸收。
在周围神经注射后存活时间：日本学者里见肇、山本悌司在胃壁注入HRP后2-3天在迷走背核及孤束核的细胞内有酶标颗粒,Law，Furst将HRP注入大鼠牙髓腔后1-2天在三叉神经半月神经节内看到标记细胞：Elfvin，将HRP注入肠系膜下节, 术后24-48h在脊神经节细胞内看到酶标颗粒。Dalsgaard[10]将HRP注入豚鼠肠系膜下节及交感颈上节后,48小时后在脊髓五个交感核内看到酶标颗粒。根据我们实验室的经验, 较大动物如兔和猫存活的时间应当长, 将HRP注入胃壁, 存活4-5天脊神经节细胞内酶标颗粒非常清晰。甚至存活7天的动物仍可见到脊神经节细胞及纤维内有酶标颗粒的出现。因此我们认为用HRP追溯周围神经联系时, 较大动物（猫、兔）存活时间适当长些。
三、固定液的问题
用HRP法显示神经细胞内标记颗粒, 无论是中枢或周围部分, 固定液的选择是个重要的关键, 在文献中多采用多聚甲醛、戊二醛混合液。戊二醛能较好的固定组织超微结构, 多用于电子显微镜技术, 虽
然对酶有一定的破坏作用, 但仍然有相当程度的酶活性可以保存下来。其缺点是穿透能力太小, 对大的组织块固定, 多在固定液中加入穿透力强的多聚甲醛来补其不足。
多聚甲醛为甲醛聚合物, 不溶于水, 但加水煮沸则可以解聚成甲醛单体而溶解, 因此用多聚甲醛灌流时须煮沸之。甲醛对酶的破坏作用比戊二醛小, 但在室温下仍可破坏HRP的活性, 所以Straus（64年）[11]认为多聚甲醛灌流液应在0-4℃时, 对动物进行灌流, 可保持HRP的活性。
多聚甲醛及戊二醛的浓度问题在文献中各不相同。用HRP法探索中枢神经的联系时, 文献报导多聚甲醛的浓度为0.4-2.5不等。至于所用的缓冲剂皆为磷酸盐缓冲液, 因为多聚甲醛在弱碱性环境下对组织固定较好, 所以pH值多在7.2-7.4之间。
在周围神经系统用HRP法显示酶标记时Elfvin和Daisgaard（77年）等人只用3-5%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate(卡钻的纳)缓冲剂内进行灌流, 可得到较好的结果。Lewreoe Furst（75年）用1%多聚甲醛加入1%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate缓冲剂内（pH为7.5）进行灌流, 效果也甚好。日本的里见肇及山本悌司在胃浆膜下注入HRP观察延髓迷走背核及孤束核的HRP标记颗粒时则用2%多聚甲醛及0.5%的戊二醛作为固定液。我们实验室将里见肇的方法加以改良, 单独用2%多聚甲醛, 不加戊二醛, 溶于0.1M磷酸盐缓冲剂内pH为7.2-7.3, 在灌流动物时用冰将固定液冷却至0-4℃进行灌流得到满意的结果。对于是否加戊二醛的问题, 我们认为戊二醛和多聚甲醛都可以做为固定剂, 戊二
醛对酶的破坏性比多聚甲醛大, 而其穿透性又比多聚甲醛要小, 所以可以不用戊二醛（此药比较贵重, 而且不易买到）。灌流液冷却至0-4℃, 这不仅是防止酶的破坏, 另一方面还可以减少酶的扩散[12]。灌流后取材, 再将组织浸泡于同一固定液1-2小时, 然后用含5%的蔗糖0.1M的磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.3）中冲洗, 洗三次（每次隔20分钟）后置冰箱内过夜, 第二天早晨切片并做成色反应。取材后固定时间要视组织块的大小而定, 从一小时到几小时不等。如组织块小固定时间长, 则可抑制酶的活性而影响成色反应。加入蔗糖的目的是保护渗透压（13）固定不良则酶易受渗透压的影响而在制片过程中HRP被扩散, 加入蔗糖的百分比, 一般认为5%-10%。
四、成色反应及辨别问题
辣根过氧化物酶的成色反应, 最初是Straus联苯胺作为成色剂。在低温或弱酸环境下呈兰色, 而在室温及弱碱情况下呈棕色。1966年Graham用3-3二氨基联苯胺（Diomino banzemdine tetrahydrcchlo）简称DAB做成色剂是棕色反应。成色反应可在DAB（或联苯胺）加H2O2液中一次完成, 也可以分为二步。将切片置于DAB（或联苯胺）加H2O2液中进行孵育是一次成色反应。如将切片先放入DAB液中置37℃恒温箱内浸泡一定时间, 然后加入H2O2再浸泡一定时间为二步完成成色反应。根据我们实验室的经验还是分两步较好。我们先将切片置于0.05%DAB液中（溶剂为含5%蔗糖的0.1MPO4缓冲液, pH7.2-7.3）在37℃恒温箱中进行予染30分钟, 然后再将予染液连同切片从37℃恒温箱中取出加入0.3%H2O2（每毫升染液中加入1毫升）
置于室温（20℃±）内30分钟进行孵育。如上述步骤HRP在神经细胞内的棕色颗粒清晰可见, 围绕着细胞核的周围成为比较均匀的棕黑色颗粒。暗视野现察, 棕黑色的颗粒呈明亮的小点与黑色的背地形成显明的对比, 恰似夏夜星空一样瑰丽。
此外, 我们的试验证明:HRP在孵育液内时间过长或温度过高则神经细胞质内呈现均匀的黄色背地。以致影响HRP棕色颗粒的清晰度, 对显微摄影及镜下观察都有一定影响。
五、用HRP法追溯周围神经联系的可靠性问题
HRP法用于中枢神经系统自从Lavail et al在1972-1973年开始建立以来, 近七、八年间, 这方面的实验工作如雨后春笋, 有许多报导。对于其可靠性问题似无非议。因为在中枢有血脑屏障, 辣根过氧化物酶（分子量）40000不能从血液进入脑组织。
关于周围神经系统HRP是否可以由神经末梢摄入, 经轴浆流入神经细胞体而不是血液运输至神经细胞内的问题。根据我们的大量试验（兔60只, 猫30只）结果, 是可以肯定的。（参见本期《胃交感内脏传入神经元的节段性》一文）。
从50年代Nauta溃变神经染色法问世以来, 神经解剖学向前推进了一步, 解决了许多没有解决的问题。70年代HRP法的建立, 更使神经解剖学的进程大大向前推进。我们目前的实验工作, 可用HRP法分别观察交感内脏传入一级神经元脊神经节细胞的节段性和体壁（足三里穴区）一级感觉神经元脊神经节细胞的节段性。如无HRP法的建立是无法进行这种实验的。因此HRP法对追溯周围神经系统的联系起到
了巨大的作用；对探讨神经解剖学中尚未解决的问题是个好的研究方法。同时, 对针灸针麻原理中经络实质的研究-体表内脏相关的问题也起到推动作用。
洪伟杰张朝晖芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制
2. HRP的作用机制
2. 1植物体内的功能由HRP催化的多数反应可由以下等式表示,
AH +H2O2---·A + 2H2O
其中AH是还原性底物, ·A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物,酚类化合物,吲哚,胺类和磺酸盐。在HRP催化反应中,自由基的形成暗示了HRP在植物胞内中可能所起的作用。这些功能可能包括一些交联反应,如: 酪氨酸交联形成双酪氨酸,交联酚类单体形成软木脂,氧化偶合酚类化合物等。当遇到一些外部因素时,过氧化物酶的交联反应就有可能启动,如: 植物组织受到创伤。当失水或有病原体入侵时,此类植物就会合成一种保护性的聚合物屏障来减少伤害, 如: 软木脂等。但是HRP在体内的作用并没有完全被阐明[ 8 ] 。
2. 2 催化机制Dunford 等[ 9 ] 广泛地研究了HRP的催化机制,尤其是HRP C。图3中以阿魏酸( ferulate)为还原性底物,阐述了一些催化循环中的重要特点。图3中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应,包括形成二倍体、三倍体、多聚体,以及启动一个以该产物为底物的反应。
催化循环的第一步是H2O2 和静态酶中的Fe( Ⅲ)反应生成化合
物Ⅰ(HRPⅠ) , HRPⅠ是一个高氧化态的催化中间体,包含一个含氧Fe ( Ⅳ)中心和一个带正电荷的卟啉。其实低温下在HRPⅠ形成的过程中还测到另一个催化中间体(HRP0) , HRP0被看成是H2O2-Fe ( Ⅲ)混合物,但是它的存在非常短暂。在正常情况下, HRPⅠ再经过两个等式就能回到静态酶。第一个等式由一分子还原性底物的加入,生成另一个含有含氧Fe ( Ⅳ)中心的催化中间体HRPⅡ。HRPⅠ和HRPⅡ都是强氧化剂,氧化还原电势接近+ 1 V。第二个等式也是有一分子还原性底物参加,使HRPⅡ还原成静态酶。在静态酶中加入过量H2O2 时,会使酶部分失活,这是由于生成了另外的一个催化中间体HRPⅢ, HRP Ⅲ又会引发另一系列的反应。HRPⅢ被认为是Fe ( Ⅲ)超氧化物与Fe ( Ⅱ)双氧化物的杂合体[ 10 ] 。
孙立水,高强.过氧化物酶的应用研究进展
辣根过氧化物酶(HRP) 使苯酚或苯酚衍生物等有机化合物褪色的机制已经被阐明[5 ] 。最近Bhunia 等人[6 ] 研究表明, HRP 在降解Remazol 等重要的工业含氮染料时,有很高的效率。Bhunia 等通过研究HRP 对多种染料(如Remazol 和Cibacron) 的作用,阐明了它的结构特征,其中包括降解染料的最适pH 值、酶的内在活性、所选染料降解的动力学常数以及HRP 在染料中或者在H2O2存在下的失活情况。由于HRP 在染料中会失去活性,因此不能广泛应用于染料污染造成的污水治理。
HRP 已经应用于聚苯胺的聚沉反应中[12 ] ,但HRP 催化苯胺的活性较低,并且在pH < 4.5 时不稳定[13 ] 。在自然界中有的过氧化物
酶在较低的pH 值时,表现出很好的稳定性,因此可以用这种酶在酸性条件下来催化聚合苯胺。
戚红卷, 陈苏红, 王升启.辣根过氧化物酶( HRP)底物的研究进展用酶标记各种特异性配体(抗体、抗原等) ,利用酶的催化放大作用和特异性作用而建立的标记免疫分析叫做酶免疫分析( enzyme immunoassay, EIA) [ 1 ]。在酶免疫分析中将在酶催化作用下产生新化合物的物质统称为底物。一种酶能催化特定的底物,将其转化为有可检测信号的产物。酶仅使底物转化为产物,本身在反应过程中并不消耗,反复起催化作用,将信号放大。传统的EIA采用色原底物测量可见光的吸光度,随着酶免疫分析技术的发展,出现了灵敏度更高的放射性底物、荧光底物和化学发光底物,而改为测量释放的射线、荧光和化学发光。由于采用放射性底物存在接触和处理放射性物质的危险,而随后出现的荧光和化学发光检测的灵敏度已经达到或超过该方法,因此放射性底物出现后不久即很少使用。目前常用于EIA的酶包括如下3种:辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase, HRP) 、碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, AP)及β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase,GAL) 。其中HRP分子最小、易于与蛋白耦联,而且呈色性好,应用最为广泛,因此对HRP底物的研究在基于酶的分析检测中具有非常重要的意义。本文对近年来HRP底物的研究进展作一综述。
1色原底物
最早的HRP底物是色原,常规的色原底物在酶作用下产生一种新的颜色(或者吸收光谱发生改变) ,这种检测方法的优点在于产生的颜
色很容易用肉眼或光谱仪器检测,检测仪器的价格一般也比其他检测方法所用的仪器便宜;缺点是检测灵敏度普遍低于其他酶检测方法。
色原底物的基本结构可用变化多样的芳香族胺和酚表示,大多数芳香胺、酚和它们的混合物在酶促氧化时会产生有色的缩聚物。常见的芳胺类色原底物包括: 邻苯二胺(OPD) 、四甲基联苯胺( TMB) 、2, 2′-连氮-双-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸) (ABTS) 、5-氨基水杨酸( 5-AS) 、邻联二茴香胺(ODA) 、邻联甲苯胺(OT)等[ 1 ]。部分色原底物的分子结构式见图1。
2荧光底物
与色原底物相比,荧光底物检测灵敏度高,而且可以同时采用几种不同颜色的荧光材料;但是荧光底物存在以下缺点:激发和检测荧光需要价格昂贵的光源、过滤器和扫描仪,检测成本高;荧光在观测期间或样品存放期间、甚至暴露于室内光线时都会衰减,导致难以获得恒定值或定量数据;另外从细胞和其他分子里产生的自发荧光(在许多活体中天然存在的某些特定化合物产生的荧光)也会对实验结果产生干扰。
常规的荧光材料难以直接用作HRP底物,但是它们与酪胺[ 4 - (2-氨乙基) - 苯酚]耦联后却可以在HRP作用下发生沉积。这种基于酪胺的荧光色素沉积技术的正式名称叫催化报道分子沉积( catalyzed reporter deposition, CARD) ,或者酪胺信号放大( tyramine signal amplification, TSA) 。该技术是由Bobrow等[ 3 ]于1989年首次提出的,其应用范围开始仅限于免疫印迹和EL ISA分析,后来则延伸到免疫组化、原位杂交等诸多领域,在基于酶的灵敏检测中得到广泛的应用
[ 4～6 ] 。
CARD的基本检测过程包括以下几个步骤:首先使用生物素化的抗体或核酸探针,通过蛋白质或核酸的结合来检测靶标的存在;接着引入链酶亲合素-HRP耦联试剂,链酶亲合素与生物素特异结合;最后引入荧光标记的酪胺底物,在HRP作用下,酪胺的酚基发生反应形成自由基中间体,该中间体与周围的物质快速反应,从而将荧光材料沉积或固定在附近区域。这个过程通过供给更多的底物(荧光素化酪胺)而重复进行,在局限区域内积聚起更多的荧光材料,最后通过激发扫描即可实现高灵敏度的荧光检测。用于标记酪胺的常见荧光材料包括:荧光素( F ITC) 、青色素(Cy3、Cy5)等。
与CARD中荧光分子只有通过与酪胺形成复合物才能被HRP催化沉积不同, Krieg等[ 7 ]合成了一类2-( 2-苯乙烯基)-苯并噻唑衍生物,这类化合物可以作为新型荧光底物直接用于HRP的活性定位,其基本结构式见图3。经过优化筛选,其中( E)-2-2-[ 4-羟苯基]乙烯基-3-乙基-1, 3-苯并噻唑碘化物的效果最好,与Alexa荧光素546酪胺偶合物相比,这种新型的底物荧光染色特异性强、灵敏度高、背景低。总之,通过将苯乙烯基苯并噻唑衍生物进行酶交联从而在HRP活性位点附近产生多重荧光色素,是一种可以替代荧光染料标记酪胺沉积技术的很有前景的方法。
3化学发光底物
化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。化学发光与荧光的区别是形成激发态分子的激发能不同,荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光,化学发光则是吸收了化学反应过程中所产生
的化学能使分子激发而发射的光。化学发光底物一般具有高化学键能,在酶的作用下化学键断裂,能量释放出来形成可见光。图4展示了一种化学发光底物—鲁米诺的发光机制。信号采用光电倍增管、雪崩二极管或其他灵敏的光学检测器检测,或者采用照相胶片显影。化学发光检测灵敏度高、背景低,因而得到广泛应用。但是这种方法也存在很多缺点:检测仪器价格昂贵,采用胶片显影又不方便;发射光必须随时采集,导致难以得到恒定值数据;要实现高灵敏度检测,需要长达数小时甚至1 d的光积分时间等。
化学发光物质大多是有机化合物,它作为氧化反应的底物,在反应中转变为激发态分子。常用的化学发光底物包括以下四类: ①酰肼类,如鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼) ,异鲁米诺(4-氨基苯二甲酰肼)及其衍生物; ②咪唑类,较常用的是2, 4, 5-三苯基咪唑,俗称洛酚碱; ③吖啶盐类,最为常用的是N, N-二甲基吖啶硝酸盐(俗称光泽精) ; ④草酸盐类,该类化合物本身不是有效的化学发光剂,它和H2O2反应生成过氧化物中间体,而这种中间体是一个最佳的化学发光关键性中间体,它能释放出较多的能量,此能量可转移至加入反应体系的另一种物质的分子,使这种物质的分子激发而发光。这类化学发光反应的发光效率很高,例如双-( 2, 4, 6-三氯基苯)草酸盐( TCPO) [ 8 ]。
近年来有研究小组陆续报道了一些新型化学发光底物并成功地应用到实际检测中。Ichibangase等[ 9 ]以2-(4-羟苯基) -4, 5-二苯基咪唑(HD I)的月桂酸酯为底物,发展了一种用于测定脂肪酶(三酰基甘油脂酶)活性的新型化学发光分析方法,该方法是基于氨基苯二酰肼
-H2O2-HRP与通过酶水解底物而产生的HD I发生增强的化学发光反应。Yakovleva等[ 10 ]将亲合蛋白通过共价键固定在硅基芯片上,开发了一种基于HRP催化鲁米诺/对碘酚的复合物化学发光氧化的微流路免疫传感器,采用带有长柔性链的各种亲水性聚合物(如聚乙烯亚胺、葡聚糖、聚乙烯醇等)对硅基表面进行修饰,随后连接蛋白A或G。为了识别和控制在细胞和聚合材料之间界面的配体-受体相互作用, Takei 等[ 11 ]研究了一种水相介质中的模式系统,这种系统以HRP为酶,以4-氨酰安替比林(AAP) 和3-(对2羟苯基) 丙酸(HPPA) 作为底物。Tang 等[ 12 ]合成1, 5-bis ( p-hydroxybenzaldene ) thiocarbohydrazone(BHBTZ) 作为一种新型HRP 底物, 实验显示抗坏血酸(AsA)对BHBTZ-H2O2-HRP反应系统具有强烈的抑制作用,因此将AsA作为酶抑制方法的抑制剂进行了分光光度测定,该方法成功地应用于茶饮料中AsA的测定。
4纳米金底物
纳米金是指直径在1～100 nm尺寸的微小金颗粒,一般以分散在水中的溶胶形式存在,因而也称胶体金。纳米金具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应等独特的物理化学性质以及良好的生物相容性,因此非常适合于生物大分子的标记和检测[ 13 ] 。但是这种胶体形式的纳米金存在一些固有的缺点:颗粒大小不一、易凝集、与生物分子以静电吸附结合,标记不稳定且假阳性率高等。为了克服这些缺点,近年来美国Nanop robes公司开发了一种新型的纳米金颗粒并命名为“nanogold”,该颗粒是以一个包含大约67个金原子的簇化物为核心的复合体,通过位于其表面的金原子与三芳基磷配基或卤化物离子结
合而形成稳定的纳米金分子,其中心粒径仅1. 4 nm,表面不带电荷,在溶液中呈离散状态。这种新型的纳米金与胶体金相比有诸多优点: ①颗粒小且均匀一致、标记密度高、穿透性好; ②经特定基团修饰后可以与生物分子以共价键结合,使得标记分子高度稳定; ③颗粒表面不带电荷,因此不易凝集,适用于很宽的pH范围和离子强度中,等等。由于nanogold的上述优点,因此一经出现便迅速应用到原位杂交、免疫组化、Western印迹检测法等生物医学检测的众多领域[ 14～16 ]。
纳米金用于生物检测的研究已有接近一个世纪的历史,20世纪80年代初免疫金银染色( immuno-gold-silver staining,IGSS)技术的出现是纳米金应用于生物检测的里程碑[ 17 ]。该技术首先用纳米金标记待检的抗体或抗原,然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使纳米金颗粒具有很强的催化还原作用,可以将周围的银离子还原成银颗粒;而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多,紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳,形成几乎肉眼可见的黑色颗粒,用普通电镜甚至肉眼即可观测。IGSS的检测成本远低于荧光和化学发光检测,与色原检测相比又显著提高了灵敏度,因此很快得到广泛应用。
为了提高IGSS的检测灵敏度,使之适用于检测组织中的稀有抗原。Lee等[ 18 ]将IGSS与免疫组化中广泛应用的TSA技术进行了结合。检测流程是首先将待检组织进行固定和封闭;然后依次加入一抗、生物素化二抗、链酶亲合素标记的HRP、生物素标记的酪胺以及链酶亲合素标记的纳米金,并分别在加入各步试剂后温育,最后加入银增强
试剂染色;样本同时采用IGSS检测,即在加生物素化二抗温育后直接加链酶亲合素标记的纳米金,然后银染。用电镜观察两种检测流程的组织切片并进行比较,结果显示IGSS与TSA结合大幅度提高了标记密度和检测灵敏度。但由于纳米金必须通过两步反应才能沉积,即HRP 首先催化生物素化酪胺反应以及随后生物素与链酶亲合素纳米金结合,因此检测过程相对繁琐。
Hainfeld等[ 19 ]制备了一种包含有机配基的新型纳米金,它的最大特点是可以直接被HRP催化沉积,因此可以作为一种新的HRP底物。制备方法是首先将金盐用水溶解,接着将谷胱甘肽和对羟基苯硫酚加入金盐水溶液,最后加入NaBH4还原即可。产物用凝胶过滤色谱纯化。通过控制反应条件,得到了粒径范围在1～3 nm (标称1. 4 nm) 、含有酚基和巯基的纳米金颗粒。Gaétan等[ 20 ]将这种纳米金底物作为探针,用于免疫组化中稀有组织抗原的标记与检测。结果显示,与IGSS结合TSA以及非放大IGSS相比, HRP催化纳米金底物沉积,然后银染的流程得到了最高的检测灵敏度和特异性,而且比IGSS结合TSA的方法简化了检测流程,更适合于稀有抗原或微量核酸等生物样本的高灵敏度检测。
5展望
HRP在酶免疫分析中占有重要地位。在前述的三类主要HRP底物中,早期的色原底物检测灵敏度不高,随后发展起来的荧光底物和化学发光底物显著提高了灵敏度,但面临的共同问题是检测仪器价格昂贵,从而限制了其应用。另外这两种底物自身也都存在一些缺陷:荧光信号易饱和、易猝灭,以及自发荧光对实验结果产生干扰;化学发光必须
随时采集,光积分时间长等。与之相比,纳米金底物具有一系列突出优点:灵敏度高,纳米金颗粒的消光系数比色原底物和荧光基团高大约1 000倍;检测成本低,采用电镜甚至目视即可检测;沉积金属非常稳定,使检测信号容易得到恒定值,等等。纳米金底物已经作为新型的标记探针,用于免疫组化中稀有组织抗原的高灵敏度检测。
基因芯片是基于核酸互补杂交的原理而发展起来的一项生物高新技术,是高效大规模获取生物信息的重要手段,在基因表达谱研究、疾病分子检测和大规模药物筛选等许多领域具有广泛的用途。荧光检测是基因芯片的常规检测方法,因此存在检测仪器价格昂贵、荧光猝灭、自发荧光等一系列缺点。近几年,已经有研究小组将金银染色技术用于基因芯片的可视化检测,但缺点是灵敏度低,不能满足分子检测的要求[ 21, 22 ]。将HRP催化纳米金底物沉积并附加银染的方法用于基因芯片的信号检测,将会大幅度提高可视化检测的灵敏度,实现基因芯片的高灵敏度可视化检测。该方法将突破荧光检测成本高导致基因芯片技术难以推广的瓶颈,展现出广阔的应用前景。
冯春梁,于洪学,李亚男,刘媛媛.储存条件对溶液中辣根过氧化物酶活性的影响
HRP以干粉态能被保存数年,但在溶液中就很不稳定. 溶液中的酶在一定的pH范围内是相对稳定的,超出这个范围后,酶就会变性失活[ 6 ]. 由于缓冲液中含有大量离子,或影响酶蛋白的构型,或影响底物的解离程度,因此缓冲溶液的种类也会对酶的稳定性产生很大的影响. 随着保存时间的延长,酶也将逐渐失活. 以往的文献报道都是将
HRP配成pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液保存,实验中发现,此条件下HRP的失活速度较快. 为了更好地了解HRP溶液的稳定条件,本文以HRP催化H2O2 氧化邻苯二胺为反应体系,利用紫外- 可见分光光度法,以反应初始速率为测试参数,考察了缓冲溶液种类,酸度条件以及保存时间对HRP稳定性的影响. 发现HRP在磷酸盐- 磷酸二氢钾缓冲溶液中保存较稳定,最佳保存pH值为8. 0, 0. 1μg/mL HRP溶液保存7天活性基本不变,保存15天活性变化明显,但保存30天后活性只有10﹪以下. 结果令人满意,对其它酶溶液的保存有重要参考价值.
2. 1pH对HRP活力的影响在一定pH值下,酶催化反应具有最大反应速率,亦即酶具有最高活力,这一特定的pH值被称为酶的最适pH值.
2. 2pH对HRP稳定性的影响酶是一种贵重试剂,所用酶溶液的浓度一般都非常小,故每次配制的量不能太少,否则会带来较大的误差. 因此,配一次溶液应该保存使用一段时间. 本文对溶液中HRP的稳定性进行了研究. 所说的稳定性是指在溶液中酶的活性发生变化的情况.
3结论
本文以HRP催化H2O2 氧化OPD为反应体系,利用时间驱动的方法,通过考察反应速率的变化来确定辣根过氧化物酶稳定性的变化. 从缓冲溶液、酸度条件、贮存时间三个方面研究了影响HRP稳定性的因素.实验结果表明,当HRP溶液浓度很低时, HRP在磷酸盐缓冲溶液中更为稳定, HRP在pH 8. 0的0. 1mol/L磷酸盐缓冲溶液中保存7天,活
性基本不变,保存30天后HRP活性基本消失. 本实验为贮存低浓度的HRP提供了一种较好的方法.
肖明丁炯左国平.辣根过氧化物酶示踪大鼠孤束核、臂旁核至中央杏仁核纤维投射的解剖
观察
摘要目的研究孤束核(NST) 、臂旁核(PBN) 至中央杏仁核(CNA) 纤维投射,为阐明三者对内脏心血管活动的调节机制提供形态学资料。方法用辣根过氧化物酶(HRP) 逆行追踪标记技术,研究NST、PBN 向CNA 投射的起始神经元形态与分布。
1 材料和方法
111 材料
成年SD 大鼠10 只,体质量180～230 g ,雌雄不拘,南京医科大学动物中心提供。
112 方法
大鼠经2 %戊巴比妥钠(40 mg/ kg) 腹腔麻醉后,参照文献[2 ]的大鼠脑定位图谱,在江湾Ⅰ型立体定位仪引导下,用接尖端直径15μm 微玻管的微量注射器向CNA 分次注入30 %辣根过氧化物酶(HRP) ,共0. 1μl ,留针15 min。动物存活24～48 h 后再次腹腔麻醉,开胸,经左心室插管至主动脉灌注0. 4 %多聚甲醛和1. 25 %戊二醛磷酸缓冲液固定液(0. 1mol/ L ,pH7. 4) 300 ml ,取脑置固定液后固定2 h ,含20 %蔗糖的磷酸缓冲液(0. 1 mol/ L ,pH7. 4) 4 ℃过夜,冰冻切片厚30μm ,按文献[ 3 ] (Mesulam 法) 进行HRP 呈色,贴成2 套连续片,其中1 套中性红复染。
禽类海马结构直接投射于禽类小脑各叶的神经元定位——辣根过氧化物酶（HRP）逆行追踪法研究
本试验研究以粤禽黄鸡、成年鸽、仙湖白鸭为试验材料，采用HRP逆行追踪法，将50％卸RP溶液分别注射青年鸡小脑Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅶ、Ⅸ各叶。成年鸡、鸽、鸭同时注射小脑Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ三叶，逆行追踪直接投射于禽类小脑各叶的起始神经元。对端脑及间脑、脑干及小脑进行冰冻切片，'IMB呈色，观察脑内标记细胞出现的位置。结果表明：
1文献综述
1．1脑与神经系统
神经系统(System nervosum)由脑、脊髓、神经节和分布于全身的的神经组成。神经系统能接受来自体内外器官和外界的各种刺激。并将刺激转变为神经冲动进行传导，一方面以调节机体各器官的生理活动，保持器官之间的平衡和协调；另一方面保证机体与外界环境的平衡和协调一致，以适应环境的变化．因此，神经系统在机体调节系统中起主导作用【l】．
神经系统由中枢神经系统和遍布全身各处的周围神经系统两部分组成。中枢神经系统包括脑和脊髓，分别位于颅腔和椎管内，是神经组织最集中、构造最复杂的部位，存在有控制各种生理机能的中枢。周围神经系统包括各种神经和神经节。其中同脑相连的称为脑神经，与脊髓相连的为脊神经，支配内脏器官的称植物性神经。各类神经通过其末梢与其他器官系统相联系。
脑(brain)是神经系统中的高级中枢，位于颅腔内。低等脊椎动物的脑较简单。人和哺乳动物的脑特别发达，可分为大脑、小脑、间脑和脑干四部分。其中大脑是神经系统最高级部分，小脑在大脑的后下方，脑干包括中脑、脑桥和延髓，由神经细胞集合成团块而成神经核或神经中枢，并有大量上、下行的神经纤维束通过，连接大脑、小脑和脊髓，在形态上和机能上把中枢神经各部分联系为一个整体。
1．1．2小脑
1．1．2．1小脑的进化
原始的小脑出现在圆口类的七腮鳗，在大多数鱼类，小脑还不发达，体积小，表面光滑，它只是横跨在第四脑室上方的一小块凸起的顶壁。软骨鱼中的鲨鱼小脑较大，表面甚至出现沟裂，这是比较特殊的例外。两栖类和爬行类的小脑不发达，表面也缺乏沟回，少数在海中洄游的龟类小脑的体积在整个脑中占有较大的比重。爬行类的小脑内部开始出现神经核团，这标志小脑接受传入信息和发出传出联系增多。鸟类的小脑非常发达，在种系发生上显得寒出。它的小脑体积大，表面沟回紧凑，位于内侧的新小脑部分特别发达，接受来自脊髓的传入纤维和来自上位脑结构的投射纤维数量增多，与之相应的传出联系也更为广泛，因而脑桥及橄榄核亦随之发达。到了哺乳类，小脑进一步发展，新小脑、旧小脑及古小脑分部清楚，表面的沟回变得更为复杂，神经核团更加分化、发达，其生理功能也更为完善和重要。
1．2神经解剖学
神经解剖学是研究神经系统形态和结构的科学，属于解剖学的一
PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使用手册
1PH0728|DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 Catalog No ：PH0728 Size ：?100mL Storage ：Store@-20℃避光保存 ◆产品简介DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA 等膜显色的试剂盒。 DAB 即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB 会产生棕色沉淀。该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB 显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 ◆试剂组分 试剂(A):DAB 显色液A---50mL (-20℃避光) 试剂(B):DAB 显色液B---50mL (-20℃避光) 试剂(C):DAB 显色液C---100uL (RT) 自备材料： 1、洗涤液 2、蒸馏水◆使用参考 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 ◆注意事项 1、DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ◆常见问题 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 ④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。 2、没有显色或显色太弱 ①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。 ②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 ③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。
辣根过氧化物酶制作过程
过氧化物酶体与溶酶体不同，过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体，因此它不属于内膜 系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细 胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。过氧化 物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2，Hydrogen Peroxide）水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。 HRP的制备 ⒈水提取： 称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在 搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次， 合并两次滤液，量总体积和度，0。 ⒉硫酸铵分级分离： 在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2 小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度） 随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离 心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸 馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析 1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成 用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。 将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。 ⒊丙酮分级分离： 将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃ 的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。 ⒋精制： 将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。
PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题
PH0728|DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit Catalog No：PH0728Size：?2×50mL|?2×100mL Store at-20℃ DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。 DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 组分 Component2×50mL2×100mL Storage DAB显色液A50mL100mL-20℃避光 DAB显色液B50mL100mL-20℃ 使用参考 1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 2.按照1:1的比例将显色液A、B液混匀，混匀后即配制成DAB染色工作液。 3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。 4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。 注意事项 DAB对人体有害，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒
DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 简介： DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western 、Southern 、Northern 、EMSA 等膜显色的试剂盒。DAB 即3,3N-Diaminobenzidine T ertrahydrochloride, 是辣根过氧化物酶的常用底物。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合, 即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 注意事项： 1、 DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、 试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 编号 名称 PW0072 2×50ml Storage 试剂(A): DAB 显色液A 50ml -20℃ 避光 试剂(B): DAB 显色液B 50ml -20℃ 避光 试剂(C): DAB 显色液C 100ul RT 使用说明书 1份
辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展
第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407 辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的 应用研究进展 周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚 (生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122) 摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三 关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料 中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一 Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang (Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial 收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12 基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费 专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021) 第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三 通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.wendangku.net/doc/f617504189.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料 对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝 改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很
辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶（HRP） 一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。 简介： 过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。 用途： 1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B . 2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。 3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。 4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。 实验原理： 过氧化物酶催化以下反应： 2 H2O2 ─→ O2+2H2O
酶和底物
酶和底物 酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有β-半乳糖苷酶、尿酶等。 1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm波长有最大吸收峰，故用A403nm与A275nm比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ不变但活力下降。 HRP的底物有可溶性和不溶性两种。 不溶性底物用于酶免疫组化技术： 可溶性底物用于酶免疫测定技术： 2. 碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。 AP不溶性底物： AP可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。 酶标记物的制备
酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。 1. 戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。 ⑴一步法：将2～5mg纯抗体与5mgA P混合于0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液1ml中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用 0.05mol/L pH 8.0 Tris缓冲液透析平衡，即可。 ⑵二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。 2. 过碘酸盐法： ⑴取：HRP 5mg溶于0.2mol／L pH 5.6醋酸盐缓冲液0.5ml中，充分溶解后加入临用前配制的0.1mol／L NaIO4 0.25ml，混匀，于4℃氧化30min（勿超过）。 ⑵加入2.5%乙二醇0.5ml，室温下放置30min终止氧化。 ⑶加入侍标记抗体（γ球蛋白或IgG）或抗原5～10mg，用1.0mol/L pH 9.5 CBS调pH至9.0，混匀。4℃过夜，使HRP与抗体或抗原结合。 ⑷加NaBH4 0.1ml（0.5mg），混匀，4℃2h，使形成的酶结合物稳定。用0.01mol／L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜平衡。 用戊二醛法和过碘酸盐法标记后，应将酶标记物纯化，常用的提纯方法为50%饱和硫酸铵和Sephadex G200(或G150)凝胶过滤。 标记率测定：标记率以A403nm／A280nm比值表示，是HRP的正铁血红素辅基特异吸光度(A403nm)与抗体球蛋白和酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸等的吸光度(A280nm)之比，表示酶标抗体中HRP所占的比例。标记率与HRP／IgG摩尔比（E／P）呈高度正相关。标记率为0.4时，E ／P之比约为1。一般以标记率0.3～0.6为合格。 固相载体 固相载体：最常用聚苯乙烯，载体形状有小试管、小珠和微量反应板。良好的载体应该是吸附性能好、不参与化学反应、能使抗原或抗体保持免疫学活性、空白值低且透明度高。
DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×)
仅供科研版本号：161208 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(20×) 【产品组成】 【保存条件】 -20℃,避光,12个月 【产品概述】 DAB辣根过氧化物酶显色液(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。【使用方法】 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):蒸馏水=1:1:18的比例混合,即为DAB染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育30min或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 【常见问题及可能原因】 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。也应请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。 ②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.wendangku.net/doc/f617504189.html,/ 第1页
辣根过氧化物酶的色原底物
辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2， 2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。 (一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。 在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol ／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。 TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。
辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
HRP 的NaIO4标记法 一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。 Note: 1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。 2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可 被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控 制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有 较高的结合效率。 3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过 碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。 4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。 有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。 二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。 三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）
1.称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮 解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶 解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防 污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于 10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。 2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用 搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。 3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可 先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。 4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。 5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。 6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值 尽量小，大约为总体积的1/20。 7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。 8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。 Note: 在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。 四．待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染） 1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要 求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。 2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。 如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。 （HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP 等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。） 3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时 以上，头两个小时换液一次。 4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半 小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加 到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一 点，反之亦然。） 5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4 （NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。 Note: 拿捏透析袋应戴手套。 五．成品酶的保存： 加等量的甘油，混匀后-20℃保存。 六．附录： 附录1：（标酶过程所用Buffer） TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。 10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：
HRP辣根过氧化酶的底物
酶的底物 3.3.1 HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD?2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP 作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温(2～8℃)可稳定1年。 3.3.2AP的底物 AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。 AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。 3.4 洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。 3.5 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 3.6阳性对照品和阴性对照品 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA
辣根过氧化物酶
用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法 辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。 将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。 Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。 至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联
HRP辣根过氧化物酶标记抗体的方法
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】 来源： 医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关 系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗 体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、 活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧 化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方 法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一)酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共固定化
葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的共固定化 摘要： 酶的共固定化是在原有的单酶固定化技术的基础上,将单酶体系改为双酶或多酶体系,或将酶同辅酶及其他与酶有相互作用的活性物质共同固定化在同一介质中形成偶联反应体系的过程。因为要兼顾不同酶的不同最适pH值、最适温度、共固定比例以及固定化次序等问题,所以酶的共固定相对单酶固定化要复杂得多。葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)是常用的两种酶，前者多提取自黑曲霉发酵产物，而后者则来自天然植物辣根，两种酶在很多领域都有极为广泛的应用。本文主要概述这两种酶的共固定化方法及对共固定化酶(HRP 是主酶,GOX提供H2O2是辅助酶)催化苯甲硫醚不对称氧化成苯甲亚砜的反应的应用。 酶的共固定化 酶催化反应具有专一性强、效率高、作用条件温和等特点，因而在生物技术、生物医学，医药化工，食品等行业具有广泛的应用价值。然而，酶制剂由于造价昂贵，将其以游离酶的形式用于生产过程，存在稳定性差，难以回收利用，产物分离难度高等缺点，天然游离酶已经越来越不能胜任规模化生产的要求，也难以同传统化工和发酵产业相抗衡。酶的固定化不仅可以解决酶的回收，下游产物污染问题，还可以提高酶的稳定性，并在一定程度上加强了酶对高温，酸，碱乃至有机溶剂等条件的承受能力，拓宽了酶的应用范围，增强了酶的应用
价值。 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOX)，属氧化还原酶类，产自真菌和某些昆虫（如蜜蜂）。葡萄糖氧化酶分子量为160kDa，由两个亚基构成，每个亚基的分子量为80kDa，并且，每个亚基的上分别通过非共价键结合着一分子的辅酶——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。辅酶FAD在酶反应过程中起着电子传递体的作用。葡萄糖氧化酶的等电点（PI）为4.2，能选择性地在有分子氧的条件下，将β-D-葡萄糖氧化为1,5-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，产物过氧化氢的积累，会对GOX 的活性起到产物抑制作用。所以要保持GOX的活性，往往需要及时地去除或者消耗掉产生的过氧化氢。 辣根过氧化物酶 辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP,E.C.11.1.1.7）是一种植物过氧化物酶，提取自常年生香草植物辣根（Horseradish）。辣根，又名西洋葵菜，作为一种香料作物在世界各地温和地区都有种植，来源非常广泛。所以，辣根过氧化物酶也是来源最为广泛，价格相对低廉的酶制剂。