研究生分子生物学实验讲义

研究生分子生物学实验讲义

分子生物学实验讲义

硕士研究生试用教材(第三版)

南方医科大学生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

分

子

生

物

学

实验讲义

硕士研究生试用教材（第三版）

编写人员 (按姓氏笔画排列)

冯春琼朱利娜吴清华宋艳斌张兴梅李凌肖应庆肖维威姜立胡子有郭秋野彭翼飞

南方医科大学生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

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前言

分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自

身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。随着科技的日新月异，分子生物学的研究

手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶

入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。分子生物学是实践性非常强的一门课程，

众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。

开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。为适应

新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重

组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要

的误差。

此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。希

望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。

生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

2

目录

第一章

基因克隆载体的制备 (1)

实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的

鉴定 (6)

第二章

目的基因的获取 (8)

实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性

酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴

定................................................ 12 实验六：酶切产物的回收 (15)

第三章

基因重组子的构建 (19)

实验七：DNA重组连接...................................................19 实验八：T载体应用时的DNA重组连接........................... 25 实验九：重组DNA的转化............................................. 29 实验十：重组子的鉴定 (31)

第四章

SDS－PAGE检测蛋白 (34)

实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (34)

第五章

附录 (38)

第一章

基因克隆载体的制备

实验一：质粒DNA的抽提与纯化

目的：原理：

采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术，

碱变性抽提质粒DNA的质粒DNA是基于染色体DNA与变性与复性的差异

而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂：仪器（见附录）：主要试剂：

实验方法：

1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫

升试管里，37℃振培过夜，16～18小时

2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒

3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟

5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰

溶液I：

50 mmol/L 葡萄糖

10 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸） 2毫克/毫升溶菌酶 1% SDS（十二烷基硫酸钠）

25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶液II： 200 mmol/L NaOH 溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5

1 mmol/L EDTA

1

感谢您的阅读，祝您生活愉快。

分子生物学实验技术实验内容讲解

2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： 1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀， 然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残 留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。

反应体系（20μl）：按下列顺序加样 反应条件：42℃ 1h 注意事项： 1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR反应体系中，应先 加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。 2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。 3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。 4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20℃，以防酶失活。 （三）PCR 实验安排： 每人做一管。 反应体系（50μl）：按下列顺序加样

实验讲义

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。 C6H i2O6（葡萄糖）T 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2 f 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。 目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混 合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。 【实验一】 一、酵母菌的分离与培养 一、【实验目的】 学习用选择性培养基分离酵母菌。 二、【实验原理】 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5?6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜 地土及果皮等植物表面。 酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基 上用划线法分离纯化出酵母菌。 三、【实验仪器和材料】 1、实验材料：成熟葡萄 试剂：0.1%吕氏（Loeffier）美蓝染液 配制方法：A 液：美蓝（methylene blue, 又名甲烯蓝）0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml 。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 2、培养基：

最新分子生物学实验指导

分子生物学实验指导

分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

分子生物学实验

分子生物学实验 （1）琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离原理 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。 相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。 最前沿的是SCDNA,其后依次是L DNA和OC DNA EB（溴化乙锭）的作用是染色剂，可以插入到DNA的双链中，在紫外线的作用下，会发出白光 电泳缓冲液的PH在6~9之间，离子强度0.02~0.05最合适，琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，。 （2）SDS法提取植物基因组DNA的原理 利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55~65度）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 （3）DNA回收试剂盒回收DNA原理 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。 先使凝胶被溶胶液溶解，然后DNA与HiBindTM DNA柱子结合，再从HiBindTM DNA柱子中洗脱出DNA片段。HiBindTM DNA柱子可以在某种适宜的情况下高效而可逆地结合DNA/RNA，除去蛋白质及其他杂质，而被结合的核酸能很容易地被去离子水或低盐缓冲液洗脱出来。 （4）利用PCR扩增目的基因原理 利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的扩人工复制，在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

分子生物学实验

实验一蛋白质印迹/免疫印迹Western blotting/Immunoblotting基本操作流程 提取组织或细胞蛋白，蛋白含量测定制备SDS-PAGE凝胶，蛋白质变性，电泳分离蛋白质电泳转膜，封闭，加一抗清洗，加二抗，清洗，底物显色（曝光） 结果分析 实验时间安排 1. SDS-PAGE胶制备 2. 样品蛋白质含量测定 3. 电泳1. 转移电泳、转印膜丽春红染色 2. 蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析 3. 膜封闭 4. 加一抗（过夜温浴4℃） 1. 洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色 2. 加酶标二抗（温浴37 ℃，1h） 3. 酶切产物纯化 4.洗膜与显示 5.结果分析 实验原理 第一部分： 1. SDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis ） Acrylamide N,N'-Methylene Bisacrylamide polyacrylamide 实验原理 实验原理 实验原理 第一部分：SDS-PAGE电泳 2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，

形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。 实验原理 第一部分：SDS-PAGE电泳 3. 蛋白样品处于pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。 实验原理 第二部分：样品的印迹（转膜） 1. 选择适当的膜并进行预处理： NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5 分钟以上。 PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。 实验原理 第二部分：样品的印迹（转膜） 2. 电流1mA-2mA/cm2，通常200mA/膜，按照 实验原理 第三部分：特异抗体与抗原（靶蛋白）结合、显色 转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot), 用于对蛋白质的进一步检测。封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。 Western Blotting 化学增强发光，X光胶片曝光显影结果 实验操作

硕士研究生分子生物学实验讲义

硕士研究生分子生物学实验讲义

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分子生物学实验讲义 (硕士研究生试用) 山西医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学实验室 2010.6

实验一动物组织蛋白质的提取 【目的要求】 1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。 2.了解动物组织蛋白质提取的原理。 【实验原理】 由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。?【试剂器材】 1．实验小鼠 2．0．9%NaCｌ 3．动物组织蛋白裂解缓冲液 Trｉs 5０mＭ ＮaCl 15０mＭ EＤTA 0.５mM DTT1mM Triｔｏn X－100 1% 去氧胆酸钠0.5% SDS０.1% 4．ＰMSF/异丙醇储备液10０ｍM（１74mg/１0ml)于-20℃储存 5．-2０℃储存的冰块 【操作步骤】 1.颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含 预冷0.9%NaＣl(6ｍL）的平皿中。 2.在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。 3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液(20μL/2mL)。 4.迅速将2mＬ预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。 5.将组织研磨液转移到１.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，１0mｉn）。 6.离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ｍｌ离心管中,即为组织蛋白粗提取液。

研究生分子生物学实验讲义

研究生分子生物学实验讲义 分子生物学实验讲义 硕士研究生试用教材(第三版) 南方医科大学生物化学与分子生物学教研室 二OO六年五月 分 子 生 物 学 实验讲义 硕士研究生试用教材（第三版） 编写人员 (按姓氏笔画排列) 冯春琼朱利娜吴清华宋艳斌张兴梅李凌肖应庆肖维威姜立胡子有郭秋野彭翼飞 南方医科大学生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月 1 前言 分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自 身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。随着科技的日新月异，分子生物学的研究 手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶 入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。分子生物学是实践性非常强的一门课程， 众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。 开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。为适应 新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重 组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要 的误差。 此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。希 望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。 生物化学与分子生物学教研室 二OO六年五月 2 目录 第一章 基因克隆载体的制备 (1) 实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的 鉴定 (6) 第二章 目的基因的获取 (8) 实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性 酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴

分子生物学实验讲义(2020版-)

《分子生物学》实验讲义 实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍 实验二质粒DNA分离纯化 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA 实验五限制酶切鉴定质粒DNA 实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍 一、实验目的 了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。 二、实验内容 1.分子生物学实验知识 ⑴严格操作规程 分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。 ⑵耐心细致操作 实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。 ⑶习惯微量操作 在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。这些观念都是错误的。只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。 ⑷防止实验污染 分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。 ⑸正确处理试剂 分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。 ⑹注意实验安全 分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。 2.分子生物学实验常用仪器介绍 ⑴微量取液器 ⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置） ⑶离心机（低速、高速、超速） ⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽） ⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）

分子生物学实验

分子生物学实验 分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。 分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。 实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。 生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。 核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。 酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。 PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。PCR扩增

过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。 蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。 总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。

分子生物学实验3篇

分子生物学实验 第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用 PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的 技术，被用于DNA的扩增和检测。PCR技术已经成为了分子生 物学和生物医学研究的基础技术之一。PCR技术被广泛的应用 于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。 PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引 物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA 片段。通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。 PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样 本量小。PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域 的应用不断扩展和深化。 随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。 第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用 RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。 RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性 配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA 的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。

RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。 在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。 第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用 基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。该技术已经成为了基础分子生物学的核心技术之一，并为生物医学和生产生物技术提供了重要的支持。 基因克隆技术主要包括：DNA分子切割、分离与纯化、DNA片段连接、转化和筛选等步骤。基因克隆技术的主要应用在于基因和蛋白的结构功能和生物学特性的研究，以及疾病诊断和治疗，还可以制备重要蛋白和药物。 基因克隆技术在分子生物学研究中已经得到了广泛的应用，并且不断开发和优化。该技术已经成为了基础分子生物学和现代生物技术中的重要工具，为生命科学和医学的研究提供了强有力的支持。 综合来看，PCR、RNA干扰、基因克隆等分子生物学技术，在基础研究和应用研究中有着重要的作用。这些技术的不断创新和发展，为生命科学界的发展带来新的机遇和挑战。

分子生物学实验

分子生物学实验 分子生物学实验是研究生命分子结构和功能的基础。分子生物学的研究对象是生命体内的DNA、RNA、蛋白质等生物分子，通过实验可深入了解生命分子的结构及其功能，为治疗疾病等产生重要的科研意义。 本文将着重介绍PCR扩增、基因克隆、蛋白质表达和酶联免疫吸附实验等分子生物学实验。 PCR扩增 PCR扩增是分子生物学领域中使用最广泛的实验技术之一。PCR扩增技术是通过不断的复制，使DNA分子增多。PCR主要操作步骤包括：DNA样品提取、模板DNA扩增、DNA回收纯化和定量检测等。 PCR扩增实验分为两部分：第一部分是制备PCR反应混合物，包括模板DNA、引物（Primer）、反应缓冲液、酶、脱离剂、种子液等。制备反应混合物的过程中，需要将所有的试剂按照一定比例混合后，将混合液均匀吸入PCR管内。第二部分是

PCR反应实验本身，包括控制PCR反应温度变化、确保每个PCR 反应的时间和温度一致、等等。PCR反应时间通常在2-6小时之间，取决于所扩增的DNA片段的长度和针对不同目标所使用的引物。 基因克隆 基因克隆是利用重组DNA技术将外源DNA和载体DNA组装重组成新的DNA分子，然后通过转化等方式将新的DNA分子转移到感受态宿主细胞中，使得新的DNA分子被细胞所接受并复制，从而达到克隆目的的一种实验方法。 基因克隆实验的主要操作步骤包括：选取适当的载体，将所需要的外源DNA和载体DNA连接起来组成重组DNA分子，将重组DNA分子转化至感受态宿主细胞中，最后从发酵液中提取所需的目标DNA分子。 基因克隆技术在分子生物学实验研究中起到了重要的作用，使得我们能够制备大量目标分子用于进一步的研究。

分子生物学实验

分子生物学实验 分子生物学实验是一种基于分子水平研究生物学现象和 分子机制的实验方法。它通过对DNA、RNA、蛋白质等生物分 子的研究，揭示生物体内发生的各种生物学现象及其分子机制，从而推动生物学的发展和进步。 分子生物学实验的方法多种多样，常用的实验手段包括DNA提取、PCR、Western blot、RT-PCR等。其中，DNA提取 是一项常用的实验技术，用于从生物样品中提取出DNA分子。这一技术可以应用于许多领域，如基因检测、疾病诊断和亲子鉴定等。PCR是一种用于扩增DNA片段的技术，可以快速获得 大量特定的DNA序列。Western blot则是用于检测蛋白质的 一种实验方法，可以用来研究蛋白质的表达水平和功能。RT-PCR是一种将RNA逆转录为DNA的技术，可以用于检测和测定RNA的含量及其转录水平。 在分子生物学实验中，实验者需要进行一系列实验操作，如样品处理、核酸或蛋白质分离、电泳、转染等。在样品处理过程中，实验者需要注意样品的选择、保存和预处理，确保实验结果的准确性。核酸或蛋白质分离是将混合物中的目标分子从其他成分中分离出来的过程。电泳则是一种利用电场将分子按照大小和电荷进行分离的方法，常用于检测DNA、RNA和蛋 白质。转染是将外源DNA或RNA导入到细胞中的过程，通常用于基因表达、基因沉默以及细胞信号传导等研究中。 分子生物学实验还需要合理选择实验方法和实验设计， 制定实验方案和步骤，并采集实验数据进行分析和解释。通过

科学的实验设计和精确的实验操作，可以获得可靠的实验结果，为生物学研究提供有力的支持。 总之，分子生物学实验是一种重要的实验方法，它为我 们深入了解生物体内分子机制提供了有力的手段。通过不断开展分子生物学实验，我们可以揭示更多生物学现象的分子机制，推动生物学领域的发展和进步。

分子生物学讲义

第1章绪论 1. 1 分子生物学的含义 分子生物学是研究核酸，蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征以及重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础科学。 当人们认识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然界的一部分，而以生物大分子为研究对象的分子生物学就迅速地成为现代生物学领域里最具活力的科学。从广义上讲，蛋白质、核酸等生物大分子结构和功能研究都属于分子生物学的范畴。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白的结构、功能和跨膜运输等都属于分子生物学的研究内容。不过目前人们通常采用狭义的概念，将分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因的复制、表达和调节控制的过程。当然，其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶结构和功能的研究。 1.2 分子生物学发展简史 早在1871年Miescher就从脓细胞中分离出了脱氧核糖核酸（DNA），但当时并不认为它是生物体的遗传物质。直到1944年，Avery等人才通过肺炎链球菌的转化实验证实了DNA是生物体的遗传及变异的物质。在1949年查盖夫（Chargaff）测定出了DNA的碱基组成，并确定了DNA 的碱基配对规律，与此同时威尔金斯（Wilkins）及弗兰金（Frankin，1950—1952）用X—射线衍射技术测定了DNA纤维结构，指出DNA是一种螺旋结构。在此基础上Watson和Crick于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。为此他们和Wilkins于1962年共同获得了诺贝尔生理医学奖。DNA双螺旋结构模型理论奠定了分子生物学发展的基础。 DNA双螺旋模型已经预示出了DNA的复制规则。科恩伯格（Kornberg）在1956年首先在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNA的合成，并从大肠杆菌中分离出了DNA聚合酶Ⅰ，并证明DNA的合成需要一个模板DNA。奥乔尔（Uchoa）发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功的合成了RNA，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg 共享1959年的诺贝尔生理医学奖 1965年，法国科学家Jacob和Monod由于提出并证实了“操纵子学说”而获得了诺贝尔生理医学奖。Jacob和Monod还首次提出存在一种与染色体DNA序列相互补，能将染色体DNA上的遗传信息带到蛋白质合成场所并翻译成蛋白质的核糖核酸，即mRNA分子。他们这一学说对分子生物学的发展起了极其重要的指导作用。 Crick在1954年就提出了遗传信息的传递规律，称为“中心法则”，但RNA如何翻译成蛋白质的问题没有解决。直到1961年Yanofsky和Brener提出了三联密码的设想，后来经过尼伦伯格（Nirenberg）和马夏（Matthai）的努力，终于于1963年破译了遗传密码。霍利（Holly）阐明了

研究生课程-分子生物学-专题篇

研究生课程-分子生物学-专题篇 3.专题篇 第十九章基因诊断 基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在，结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 基本原理：检测DNA或RNA的结构变化与否、量的多少及表达功能是否正常，确定受检者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病诊断的依据。 意义：不仅能对疾病作出早期和确切诊断，而且能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期、分型、疗效监测、预后判断等。 第一节基因诊断的技术方法 一、常用的分子生物学技术 （一）核酸分子杂交 包括Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization等 （二）聚合酶链式反应（PCR） 常与其他技术联合应用 （三）单链构象多态性检测（SSCP；single strand conformation polymorphism） 是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR 联用， 称PCR-SSCP. PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和 变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。 （四）限制酶酶谱分析 限制性片段长度多态性（RFLP；restrict fraction length polymorphinsm） （五）DNA序列测定

是进行基因突变检测最直接、最准确的方法，不仅可确定突变的位置， 而且可确定突变的性质。 （六）DNA芯片技术 实际上是一种快速、敏感、高效、自动化的核酸杂交技术 二、基因诊断的基本方法 特点: 1：特异性强检测特异性高达100% 2.早期诊断 3.灵敏度高检测灵敏度达毫微微克(fg)水平 4.取样方便任一有核细胞均可作为检测样品 （一）基因突变的诊断 1、点突变的诊断 （1）已知的点突变 可采用PCR/ASO（等位基因特异性寡核苷酸；allele specific oligonucleotide）探针法检测。 （2）未知的突变 PCR-SSCP；DNA序列测定；DNA芯片技术；等 2、少数核苷酸缺少或插入 探针法 3、大片段丢失或插入 PCR；多重PCR（因为常规PCR扩增2kb 以上的片段比较困难） 4、基因重排（染色体易位） PCR；原位杂交（包括FISH）； 5、基因扩增 Southern blot（先用酶切，再作blot） （二）多态性分析 1、RFLP分析 （1）限制酶酶谱直接分析法 （2）RFLP间接分析法

分子生物学实验讲义

分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。

分子生物学实验

分子生物学实验 实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用 100ml量筒定容至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。

(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶 50ml固体LB培养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开 排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄 的一层即可。每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中 加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉 我们关于该菌种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能

分子生物学试验教学教案

分子生物学试验教学教案 分子生物学实验教学教案(3000字) XX科技大学 实验教学教案 课程名称分子生物学 指导教师李市场 XX科技大学实验教学教案首页 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。实验原理将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DN。 转化(Trnsformtion)是将外源DN分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DN分子进入体内并稳定地遗传给后代。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来操纵。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

2. 质粒的质量和浓度: 1ng的cccDN即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DN溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CCl2 等均需是最高纯度的(GR.或R.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DN的污染。 本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞,并用CCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。由于pUC19质粒带有氨苄XX霉素抗性基因(mpr )，可通过mp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19，则在含mp 的培养基上不能生长。能在mp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 一. 仪器控温摇床(37℃) 高速冷冻离心机 水浴锅冰箱（-20℃,‐70℃） 超净工作XX培养箱(37℃) 752分光光度计灭菌锅 二. 试剂CCl2 无菌水,冰 胰蛋白胨酵母粉 mp NCl 三. 其他用品 移液器，枪头