基因组学研究进展论文
TILLING技术
姓名：罗洁学号：M201071486
院系：生命科学与技术学院
摘要：TILLING技术是一种全新的反向遗传学研究方法，它提供了一种高通量，低成本，规模化和高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING技术的原理和特点，并对其在植物功能基因组学，作物品种改良和在生物进化及检测多态性中的应用作了初步探讨。
Abstract: TILLING technology is a kind of brand-new reverse genetics study method, it provides a high throughput, low cost, scalization and efficient screening chemical mutagen EMS induced produce point mutations of technology. This paper briefly introduced the TILLING technology principle and characteristics of plants, and in its functional genomics, crop cultivar improvement and in biological evolution and testing polymorphism application was discussed
关键词：TILLING技术反向遗传学点突变
前言
随着越来越多的植物的基因组测序的完成，以表型筛选为主的正向遗传学方法正逐步被反向遗传学方法替代而成为功能基因组学研究的主要方法。反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学研究的方法，但这3种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程，作为常规方法仅限应用于极少数物种[1]。
基因组靶向定位诱导损伤技术(targeting induced local lesions in genomes，简称TILLING)是美国华盛顿Hutchinson癌症研究中心以Henikoff为首的科学家发展建立的[2]。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li—Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。在TILLING技术基础上发展起来的Ecotilling(ecotypic TILI ING)技术不用化学诱变，可以直接探知存在于特定群体中某个基因或基因群的多态性(等位基因)，识别单碱基突变(SNP)、小片段插入、微卫星重复等，为基因功能研究和生物进化提供重要信息[3]。
最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突变进行检测（McCallum et al., 2000a; 2000b）。为了进一步提高这个方法的效率，适应大规模筛选的要求，Colbert 等（2001）对TILLING 作了改进。他们将所获PCR 片段先用特异性识别错配碱基的内切酶酶切异源双链核酸分子，再用变性的序列胶电泳分离酶切产物，用标准的图像处理程序分析点突变的存在。有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识别、切割，包括S1 核酸酶（Howard et al., 1999）和T4核酸内切酶Ⅶ（Youil et al., 1996）。目前，使用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELI酶，它是一种从芹菜（celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶（Oleykowski et al.,1998）。CELI 酶能够识别错配碱基并在错配碱基的3' 端进行切割，再用变性的序列胶（PAGE）分离酶切产物，能够将超过1kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此，改进的TILLING 充分运用了CELI 酶和凝胶电泳技术，从而使其成为一个低成本、高通量的筛选突变基因的技术平台。
TILLING技术的基本原理是：首先是运用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变而获得突变群体，提取DNA并把多个待测样品DNA混合建立突变群体及其DNA池，然后利用特异性引物对特定DNA区段进行PCR扩增，通过变性和复性过程得到异质双链。如果有突变发生，那
么形成的异质双链中将含有错配碱基。利用特异性的核酸内切酶识别错配碱基的异质双链并在错配处切开双链，最后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。如果发现阳性结果，则再在混合的样品中逐一检测，最后确定阳性样本。
1 TILLING技术路线
TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，而后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析[4]。包括S1核酸酶和T4核酸内切酶Ⅶ在内的几种酶已用于碱基错配的特异性识别和切割，其中应用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELl酶[5]。这个过程中起重要作用的CELl酶是从芹菜中分离的植物特有的核酸内切酶，它能够识别单碱基错配并在错配碱基的3 端进行切割，酶切产物经变性PAGE胶分离，能将超过1 kb的PCR产物内的点突变定位在几个碱基对内[6]。TILLING 的具体操作步骤是[7]：⑴EMS（Ethyl Methane Sulfonic acid）处理种子，诱导产生一系列点突变；⑵将种子培养，获得第一代突变个体（M1）；⑶M1 植株自花授粉，产生第二代植株（M2）；⑷M2 植株抽提DNA 存放于96 孔微量滴定板，并保留M2代种子；⑸将多个96孔板的DNA 样本合并到一个96孔板内（最多可合并8 个）得到DNA池；⑹根据目标基因序列设计一对特异性引物进行PCR 扩增，两个引物分别用700nm和800nm荧光染料标记；
⑺PCR扩增片段变性、退火，从而得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；⑻用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子；⑼酶切产物用变性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝胶电泳分离，然后用标准的图象处理程序分析电泳图象，获得突变池；⑽利用相同方法从突变池中筛选突变个体；⑾突变个体PCR片段测序验证；⑿突变表型鉴定
1.1 TILLING技术中的引物设计
根据目标基因序列设计特异引物，是TILLING分析的一个重要步骤，引物设计的好坏直接影响TILLING筛选的结果。Taybr和Greene专门为拟南芥TILLING 项目研究开发了CODDLE程序[8]。CODDLE不仅能识别各种形式的序列信息，按输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，还能列出EMS诱导植株产生有害突变的可能范围，当1 kb左右的区段被选中后，系统将会根据最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物[9]。设计完成后，研究人员可用Primer3程序对C0DDI E列出的候选引物加以选择口，然后在MWGBiotech订购引物。TILL ING引物设计的前提条件是要知道自己想研究基因的序列信息，其基因序列信息可以是基因组序列，也可以是cDNA序列[10]。在应用Ecotilling于生物进化研究和检测多态性时，可以选择非编码区设计引物来获得更多的信息[11]。
1.2 TILLING技术中点突变的检测
点突变通常存在检测困难的问题，这也是TILLING应用上的关键障碍。Collhert等将LI—C0R 4300 DNA遗传分析系统的双色红外荧光检测技术引入TILLING中，大大提高了筛选效率[12]。由于杂质、干扰分子在红外光区几乎不发光，用红外荧光检测不仅背景非常低，灵敏度也很高。而TILLING实验过程中由于核酸外切酶活性会导致一些信号丢失，因此应用红外检测技术提高灵敏度对于TILLING检测非常重要。相对常用的可见光检测，红外荧光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外，结合红外荧光引物后，该检测方法还具有另一个优点——宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI—CORDNA分析系统也能够轻松识别突变。应用TILLING技术时，获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理，很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，可以同时获得两张真实的电泳图像，分别在700 nm和800 nm通道采集，这两个通道检测波长相距100 nm，几乎无光谱重叠的干扰，保证TILLING分析中每
个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断，由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记，如果真的发生了突变，双色检测时将在野生型条带下面出现两个突变条带，分别位于700 nm和800 nm电泳图的同一泳道。同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因而双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。
1.3 TILLING技术中突变体及表型的鉴定
一旦在一个DNA池中检测到了一个突变，那么就要对这个DNA 池中每一个单株的DNA 样品进行筛选。单株的DNA样品可以排列在一个8×8的微量滴定板中，每一个DNA池对应一排(8个)DNA样品。用一个有8个吸头的移液器将阳性DNA 池对应的8 个DNA 样品转移至一个新的微量滴定板（8×12）中。因此每块板可以对12 个阳性的DNA 池中的所有单株进行筛选。利用UNIX程序（pick）可以方便的将要筛选的每一块96孔板的每一行与阳性DNA池对应起来，并能以表格的形式将结果输出。为了能够检测出突变，每一个单株的DNA 样品中等量混入野生型DNA样品。然后用与筛选DNA池同样的方法筛选突变个体，包括PCR 扩增，CELI酶切，凝胶电泳，Grab、Photoshop 等软件分析。筛选结果能将突变位点定位在几个碱基对内。用这种两次筛选的方法，筛选1kb左右的目标片段，每块胶大约可以筛选750kb的基因组序列（1kb×8个单株DNA×96孔）。每个96孔DNA池相当于768个单株，平均可筛选到7个点突变。通过GelBuddy／SAGA软件分析所获得的电泳图像，在混合池里发现了突变，再检测混合池里的单株，最后通过测序来确定突变单株。获得突变序列之后，可以通过在SIFT和PARSESNP软件上预测确定了的突变类型。随后可以对获得的错义突变和基因截短型损伤两个突变类型后期突变表型的确认。第一种快速的方法是鉴定两个独立有害突变位点的个体，将二者杂交，分析后代的基因型。在每个含有非等位基因的个体中，均会发现一个属于两个亲本之一的突变表型，而将不等位的突变单独归类；第二种就是将突变体与野生型杂交，观察突变是否与表型在F2代共分离，F2代的突变体检测可以采用TILLNG 和dCAPS标记；第三种方法就是通过用目的基因进行转化看能否使突变体的表型得以恢复，从而将表型与目的基因联系起来[11]。
2 TILLING技术的核心与特点
2.1 TILLING技术的核心
由上可见，如何有效识别异源双链中错配碱基是TILLING技术的核心。从芹菜里提取的核酸酶CEL I是被认为具有高度特异性识别错配碱基的真核剪切酶，它可以识别双链DNA中错配的碱基，但对各种错配碱基切割偏爱程度并不完全一样，表现为C/C≥C/A~C/T≥G/G> A/C～A /A~T/C>T/G~G/T~G/A~A/G>T/T[13] .CEL I的最佳pH值为中性，具有274个氨基酸残基，分子量约31．44kDa,切割时需要Zn2+参与，同时Mg2+对其有效的切割3’端错配核甘酸也具有帮助[14]。CEL I不仅能识别错配碱基并能在错配碱基的3’端进行切割，再用变性的序列胶(PAGE)分离酶切产物，能够将超过1 kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。CEL I的引入是TILLING广泛应用的基础，大大地提高了TILLING的工作效率[15]。
在TILLING中，引物设计的好坏直接影响着对突变筛选的结果，所以在确立所要筛选的目标区段后，如何根据目标序列设计引物就成为TILLING的一个重要方面。幸运的是在拟南芥TILLING项目(Arabidopsis TILLING project，ATP)研究开发了CODDLE(codons optimized to discover deleterious)程序(http：／／www．proweb．org／coddle)，该程序能够识别各种形式的序列信息，并能根据输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，能够列出EMS诱导植株产生有害突变的可能范围，当1 000 bp左右的区段被选中后，系统就会根据最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物，结合其他引物设计程序(如Primer3或Primer5)可对CODDLE列出的候选引物进行选择[16]。
点突变的检测和突变体的鉴定是TILLING的另一个核心内容。通常点突变很难被检测，要求
检测仪器不仅要灵敏度高，还要能够准确识别假阳性位点。Colbert等[17]将双色红外荧光扫描系统(LI—CORDNA分析系统)引入TILLING中，大大提高了突变筛选效率。用一对不同荧光标记的特异性引物扩增DNA，扩增产物经加热变性和缓慢降温随机复性后，在DNA池里只要有一个突变就会形成异源双链核酸分子，这些双链产物将被核酸内切酶剪切，再经变性聚丙烯酰胺凝胶双通道电泳分离即可筛选出突变。由于两个剪切片断采用的是不同的荧光染料标记，在两个图像中上下方都会出现一个条带，可以通过估计载有3’和5’端标记的这两个条带的大小来推测点突变所在位置。一旦在某个DNA池中检测到突变，可对这个DNA池中每-DNA样品按相同的方法进行二次筛选而检出突变个体。虽然TILLING技术大幅度减少了突变筛选的工作量，但是后期突变表型的确认仍需很多工作。通过杂交、测交等，可对产生后代的表型进行确认，明确突变对表型的影响和突变之间的等位关系.
2.2 TILLING技术的特点
2.2.1 一种全新的反向遗传学研究方法
反义RNA抑制和插入突变是现有利用基因敲除策略开展反向遗传学研究的两种主要方法[18]。但是，要获得并分析基因组中每个基因的敲除突变体，事实上难以实现，因为：(1)某些必需基因控制基本的生物功能，插入突变将导致个体致死，因此无法获得该类突变以分析它们的功能(2)有些基因本身很小，有待插入的目标区域也就很小，难以获得刚好敲除该基因的突变；(3)很多基因具有多个拷贝或是相似的复等位基因，要获得同时对一个基因不同的拷贝或复等位基因的所有位点均敲除的突变可能性很小，导致无法分析该基因的功能。目前，对RNA 干扰(RNA interference，RNAi)的研究十分热门，然而RNAi抑制的机理仍旧不明确，表现在后代表型的多样性及不可预见性[19]。同时，上述技术均依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，需耗时的转基因和复杂的组织培养，作为常规方法加以应用目前仅限于极少数物种[20]。
与其它基因敲除的突变方法相比较，TILLING技术的基本点是诱发突变和突变的高效筛选，即有效结合高频率点突变和PCR筛选技术，可发现错义突变、基因截短型损伤等突变类型，表现了3方面的技术优势。(1)可获得大量的等位基因系列，对一些表型分析时可能涉及的亚致死必需基因、长度很小基因、复等位基因等具有独特的技术优势(2)可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体；(3)不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养。
2.2.2 高通量，低成本，可自动化操作
由于集成了高通量的电泳检测设备、优秀的图像处理系统和分析软件及一种能够给96孔微量滴定板自动加样设备等多种技术，TILLING可自动化操作[13]。目前，在拟南芥研究中TILLING已实现完全自动化[20] 。对突变体的规模化筛选，TILLING无需借助先进的仪器设备，是一种高通量且相对廉价的实用技术。筛选每块96孔微量滴定板相当于筛选了768(8×96)个M。单株，每个目标筛选区段大约为1 kb，那么每块胶大约可以检测750 kb的基因组序列。一个技术员一天就能完成4轮筛选，可检测3 000个突变株，相当于检测了300万个碱基对。对于突变频率高的群体，一天可筛选出2O个突变，至少可以鉴定出一个基因。此外由于荧光标记引物的价格是普通引物的10倍，通过巢式PCR减少荧光标记引物的使用量来降低成本，也可以减少因DNA模板的质量和浓度不同而造成的影响。
2.2.3 能有效排除假阳性
TILLING采用了双色红外荧光检测技术(通过Li—Cor 4300 DNA遗传分析系统)来检测CELI酶切产物能够有效排除假阳性条带。假阳性通常存在两种情况：一个通道的电泳图中多个泳道出现阳性条带或者两个通道获得的两张电泳图相同泳道在相同位置出现阳性条带。因为多个单株出现相同点突变的可能性很低，推测发生前一种情况的可能是由于某种同源双链对CELl 酶特别敏感，能被其酶切，使得同样条带出现在一张电泳图的不同泳道上；发生后一种情况
的可能是由于错误导致产生大量的相同大小的双末端标记产物。因此，采用双色红外检测技术具有非常明显的优势，只有两个通道获得的两张图片在同一泳道出现片断大小之和与野生型条带大小相等的情况下，才是候选的阳性点突变。应用TILLING技术时，获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理，很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。Colbert[7]等研究发现，当仅用标记引物扩增时，PCR产物的产量比较低且不稳定；当把标记的引物和非标记的引物混合后扩增，PCR产物则会相当稳定。此外，由于错配和不完全延伸的影响，在电泳图的1oo～200 bp位置产生一定程度的背景带，影响到突变体的检测。通过对产物的纯化也不能完全解决，需要进一步研究解决[20]。
2.2.4 估算突变的概率，指导突变群体的构建
众所周知，EMS主要诱发产生3种类型的点突变：第1种诱导密码子变为终止子，使翻译的蛋白质失去功能，形成无义突变；第2种诱导突变发生在编码区以外或以内，但不改变氨基酸编码顺序，形成沉默突变；第3种诱导突变引起氨基酸编码顺序的改变，形成错义突变。EMS主要诱导碱基从C到T的突变，从而引起碱基从C：G到T：A的转换突变。根据不同作物的氨基酸编码特性，可大概估计3种突变的发生比例，如拟南芥中大约5 的突变是无义突变，35 是沉默突变，65 是错义突变。同时，我们可以根据实验对象的染色体倍数来尽可能地提高突变频率，减小群体大小[21]。因此，利用TILLING技术可预先估算突变的概率，指导突变群体的构建。
但是，该技术也有其不可忽视的缺点。首先利用该技术进行反向遗传学研究的前提条件是要知道所研究基因的序列，这在目前来说对许多植物而言是做不到的。其次，在多倍体植物里面，如甘蓝型油菜、小麦等植物，本身就是多基因组，那么就很容易将植物不同基因组之问的单个碱基的不同当成突变。还有就是相对于插入突变和RANi，在TILLING利用中，可能会出现多位点的突变，后代的表型鉴定比较繁琐。
3 TILLING技术的应用
3.1 在突变特性研究中的应用
尽管EMS用于植物诱发突变和正向遗传学的研究已经有几十年的历史，但真正从分子水平上阐明其诱发突变特性的研究报道并不多。而TILLING技术在突变的研究和筛选中具有很大的应用潜力. 利用TILLING技术对3类不同的点突变频率也可以估算。突变频率的估算对突变体的选择、构建突变群体都具有重要的指导意义。
3.2 在SNP检测和发掘中的应用
SNP是指基因组内单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换和颠换，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。单核苷酸多态性是基因组中最丰富的遗传变异，对于功能基因组学研究和建立分子标记都具有重要的利用价值。
发现和检测SNP的方法有多种。原则上任何用于测定单个碱基突变或多态性的技术都可用来发现和识别SNP。尽管有许多的方法可用于检测基因型和目前已知的SNP，但适用于发现新的SNP的方法并不多[23]。适用的方法首先应该是高通量并且对存在于大量样品中的少数SNP的检测具有敏感性；其次，分析费用要低，这也是实际工作中需要考虑的因素；另外一个应该考虑的指标就是在不同品种检测中能否在共同背景下检测稀有变异的能力。对所要研究的目标片段进行测序固然是一种有效而可靠的方法，但测序的费用很贵，而且费时:其他以凝胶电泳为基础的检测方法，如单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等，不能确定所分析DNA片段中突变的类型和位置[16]；依赖于变性动力学的定量PCR技术也能用于SNP的检测，但只适合于对小片段的分析：质谱也能够用于检测SNP，但是它需要PCR 片段转录为RNA，在分析之前还需要用四种酶进行预处理，同时在费用上也不具有竞争优势[15]：利用芯片杂交技术和变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测SNP可以实现高通量，但芯
片杂交技术只能检出约50％的SNP，而DHPLC中对每个DNA片段的分析则都需要优化相应的运行温度[24]。
TILLING可以作为一个很好的SNP检测方法，因为它具有高通量、高敏感度和经济的特点；CELI剪切的DNA片段明确地揭示SNP的所在位置，大大地简化了后续分析；最重要的是它可以不考虑遗传背景的变化，当SNP频繁发生时，TILLING也仍然能够检测。这使其在检测人类基因多态性和筛选致病基因中也具有重要的利用价值[25]。
3.3在反向遗传学和功能基因组学中的应用
反向遗传学的目的在于通过表型分析来阐明已知序列基因的功能，常用的研究手段有DNA 插入诱变[8](包括T-DNA和转座子插入诱变)和基于RNA的基因沉默技术。但这些手段都存在某些缺陷，从而使这些技术在反向遗传学的应用中受到很大的限制[26]。
采用DNA插入诱变和基于RNA的基因沉默等技术时都依赖于转基因方法来引入外来DNA。对拟南芥这种模式植物来说，基因的导入已不是限制因素，而对于其他大多数植物来说，转基因的效率不能满足需要，而且再生过程往往会碰到许多困难。所以采用转座子和T—DNA 进行基因剔除，只能应用于那些遗传转化体系和再生体系比较成熟的物种。当目标植物在转基因和再生方面存在困难时，采用这些方法则会受到一定的限制，而TILLING技术恰恰可以避免此类问题的发生。TILLING技术有效结合了化学诱变方法的高频率点突变和现代分析技术，与其他反向遗传学手段相比，具体表现在以下三个方面的优势：(1)可获得点突变的系列等位基因，对可能涉及到亚致死基因的表型分析具有独特的优势；(2)可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因只需要较小的突变群体；(3)不依赖于农杆菌介导转化或转座子标签系统，不需要较为耗时的转基因操作和经过烦琐的组织培养过程。
TILLING的显著优势在于它可以对基因组特定目标区域内多个突变位点进行鉴定。这些突变有可能构成一个等位系列，产生一系列由弱到强的表型效应，有利于进行结构与功能的研究。这些突变也可能涉及某些特定代谢机制的变化，而不是改变特定基因产物的有效水平。比如说，编码区突变的基因翻译出的代谢酶与底物的亲和力减弱，改变酶的调控区域，或涉及与某些亚基或蛋白质互作的变化，这些改变在代谢途径中都会有很大的影响。有些突变能使酶的结构域发生改变，因而改变酶与底物的亲和力。或者影响对底物的结合或是其他蛋白质与蛋白质的互相作用。在代谢途径中，上述的某一改变则会导致极大的影响。因此，在一些重要作物中，当缺乏对有益目标基因产物的了解时，TILLING为对这些基因的研究提供了一条潜在的途径，对功能基因组学研究来说也是一个有用的工具。
3.4 在资源分析中的应用——Ecotilling
TILLING技术在检测自然变异中也具有很大的潜力。随着测序工作的开展，有许多的物种基因组序列己知，但有些物种并不适合于传统的突变及遗传学分析方法。对于这些物种，研究它们的野生型多态性可以提供更多的基因功能信息，并且有助于把图谱与连锁不平衡分析联系起来。即使在那些己知遗传信息较多的物种中，例如拟南芥，对那些利用突变尚未鉴定的特性。也可以通过分析自然资源来阐明。同时，对自然资源的SNP的研究可以提供物种适应策略和群体历史变迁的线索，而适应策略和群体历史变迁对研究物种进化具有重要作用。在近亲交配物种中，例如拟南芥，大多数位点是纯合的，在对来自不同材料的DNA建池时，需要设置一基因型做参照标准，因为特异性剪切酶只能剪切错配基因位点。而对远亲交配的物种来说，如杨树，它们具有高度的杂合性，所以Ecotilling不仅可以用于检测变异程度，还可以评判特定基因的杂合水平。为确定来自同一群体的不同个体中特定基因的核苷酸序列变异情况，通常需要测序，而Ecotilling的一个强大之处就是可以减少测序的工作量，通过Ecotilling，只要对一到两个具有代表性的样品的测序分析，就能够显示任一特定位点的DNA 多态性情况。另外，通过对相对不保守非编码区中保守区的鉴别，TILLING可以帮助鉴定调控域。Coma／等最先运用TILLING技术分析了96份拟南芥材料的5个特定基因的自然变异，
并将其称之为Ecotilling，他们的研究结果表明，Ecotilling不仅可以检出DNA序列中单碱基的变化，而且还可以揭示小片段的缺失、插入及微卫星多态性。Wu等[18]利用绿豆核酸酶代替CEL I对甘蓝进行了多态性分析，进一步证明Ecotilling可有效地用于自然资源的评价。最近，Gilchrist等[18]利用Ecotilling对棉白杨的9个特定基因位点进行了分析，发现了63个新SNP。认为这些SNP可以作为标记应用，其研究结果从一个侧面对来自不同地域棉白杨的核苷酸序列多样性勾画了较为精确的图谱。
3.5 在创造突变资源和作物品种改良种的应用
利用TILLING技术可以诱发和高效筛选突变。这对作物品种改良将具有重要意义。起初TILLING是在已经测序的模式二倍体植物拟南芥中建立起来的。而对于那些遗传背景更为复杂、具有重要意义的多倍体农作物效果如何并不知晓。Slade等[26]的研究结果给予了肯定的回答。他们利用TILLING技术定向诱发突变和对蜡质基因突变进行筛选。在六倍体普通小麦及四倍体硬粒小麦中鉴定出了约250个新的等位基因，有94种被认为与改变编码蜡质基因产物有关，还发现了两个显著突变的蜡质基因座，并检测出一个相近的蜡质表现型，而传统的育种方法无法发现这一结果，因为表型筛选根本不能从野生型中辨识出这两个点突变。其结果表明了TILLING技术可以迅速产生并检测出许多新的等位基因，并且已证实其中一些等位基因与性状有关，这些等位基因展现了丰富的遗传多样性，在提高淀粉品质和特性方面具有很大的应用潜力。
利用TILLING技术，在水稻[27]、大麦[18]、玉米[28]、百脉根等植物中也进行了诱发突变和突变体筛选的研究，获得了多种不同类型的突变体，突变性状涉及到植株结构、器官形态、生长发育、产量构成因素以及病虫害抗性等，这些突变体的创造，不仅为开展基因功能研究提供了良好的材料，也为品种改良提供了丰富的遗传资源。
Caldwell等[28]认为，TILLING对于有较大基因组的作物具有如下优势：(1)对于大多数植物而言，EMS诱发突变的频率较高，而且不受基因组大小的影响；(2)耗时较短，一般来说，通过加代繁殖，具有较大基因组的农作物一年可繁殖2代，所以在实际工作中一年半就可以产生所需要的突变群体；(3)由于EMS诱发突变不涉及转基因操作，其后代可直接种植于田间而不受任何限制，产生一系列的等位突变有利于表型分析，而且对突变的筛选是从DNA水平上直接鉴定和选择的，这样被鉴定出的突变就可以作为选择标记，加快其渗入分子育种的步伐。因此。TILLING技术可有机结合诱变技术和生物技术，作为分子育种的特例用于农作物突变分子育种[29]。
4小结
在反向遗传学领域里TILLING是个具有重大意义的研究手段，它集有效、经济于一身，能运用于诱变群体，也能使用于野生物种的遗传评价。TILLING能直接检测出目标突变，这一点很好的补充了其他技术在这方面上的运用。另外，它是极少数的能够在植物DNA中高通量检测错义突变基因的技术之一。而错义突变在阐明基因功能及基因间相互作用中具有重要的作用[29]。TILLING技术能够在目的基因中快速测定出点突变，这一点是具有很强竞争力的，而使用转座子或T-DNA剔除特定基因，虽然可以准确测定表型。但需要进行耗时的转基因和经过烦琐的组织培养过程，而且这些方法是将整个基因剔除，无法观察到活性基因功能部分丧失的结果。但TILLING也不是十全十美的，也有其缺陷，例如检测的大部分DNA池中不含错配[30]，单从DNA水平上检测的突变也可能是不表达的，而且要做到高通量也需要特殊设备。虽然说随着反向遗传学和功能基因组学研究技术的不断创新和发展。更新颖的技术总有一天会取代TILLING技术，但在目前及今后相当长的一段时间内，TILLING技术仍是一种较好的选择
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关于基因组学的论文
公共卫生面临的基因时代 摘要：随着生物－心理－社会医学模式的转变，人类医学进入基因组时代，海量的生物医学信息在疾病防治领域的应用带给公共卫生前所未有的机遇和挑战。而作为公共卫生的主要学科----预防医学的理论发展和研究方向也发生相应的改变，基因组时代的医学对预防医学不仅是挑战，更是一个新的起点。 关键词：公共卫生；基因组时代；预防医学；机遇与挑战 公共卫生的发展与医学进步和人类健康密切相关，具有鲜明的时代特征。疾病预防的理念也在渐渐的被赋予新的内涵。近年来，人类基因组计划，人类基因组单体型图计划（HapMap Project）和全基因组关联研究（Genome-wide Association Study ）相继启动和完成，标志着生物医学进入了基因组时代，生物学界和医学界因此积累了大量宝贵的健康资源。因此科学家预测，充分利用基础医学的研究成果为疾病的个体化防治服务，将预示着一个新的公共卫生时代的到来，即基因组时代的公共卫生。基因组时代的公共卫生是对传统意义上的公共卫生的继承和发扬。 首先，新的研究技术和手段以及多学科的交叉和合作为预防医学研究增添了新的活力。 基因组学的目的在于阐明基因组的结构与功能。基因组学发展至今，仍有相当多的基因功能不清，这对环境有害因素的致病机制、营养对防治疾病的机制、传染病以及各种慢性病的发病机制提出了挑战，同时也提供了机遇。基因组学研究技术在预防医学领域有广泛的应用，如DNA重组技术应用于乙肝重组亚单位疫苗的研制并成功地在我国推广应用。 基因克隆技术的应用产生转基因或基因敲除动物和细胞株，转基因技术可导入外源性的或发生突变的基因片断，在染色体基因组内稳定整合，使导入的基因能进行稳定的遗传并表达，把基因敲除与转基因技术完美地结合在一起，可以用于研究和发现重大传染病或慢性疾病的新基因及功能。 而且，用于以核酸杂交技术为基础发展起来的聚合酶链反应(PCR)技术可以进行各种致病病原体的检测，不仅可以做单一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性。对于难于培养的病毒(乙肝)、细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体) 等来说尤为适用。 不仅如此，质粒图谱分析技术、限制性内切酶图谱分析以及寡核苷酸图谱分析等，在病原体检测、分型、鉴别致病性、分析变异以及宿主作为传染源的传染性和测定排毒期的长短等研究中也有着广泛的应用。 其次，分子流行病学与基因多态性研究也为公共卫生带来了实际指导意义。 分子流行病学不仅将分子生物学技术用于研究病原微生物的蛋白质和核酸分子结构的差异，以阐明疾病的流行病学特点，同时也用来检测暴露于外来化学致癌物中的DNA 特有分子标记，以表示DNA 受损程度并观察其后果。我国预防医学领域中关于基因多态性的研究既包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，又包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛检，涉及的疾病有肿瘤、神经系统、生长发育、循环系统和骨骼疾病等。基因多态性的研究在职业医学领域更具有实际意义。 通过对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别出来，采取针对性预防措施，将提高预防职业环境中接触污染物的种类
进化基因组学研究进展
研究进化基因组学进展 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 正文 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。 一、目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学、基因注释的等方面；在新基因方面
第3章 人类基因组学
第三章人类基因组学 基因组指一个生命体的全套遗传物质。从基因组整体层次上研究各生物种群基因组的结构和功能及相互关系的科学即基因组学。基因组学的研究内容包括三个基本方面，即结构基因组学，功能基因组学和比较基因组学。 人类基因组计划（HGP）是20世纪90年代初开始，由世界多个国家参与合作的研究人类基因组的重大科研项目。其基本目标是测定人类基因组的全部DNA序列，从而为阐明人类全部基因的结构和功能，解码生命奥秘奠定基础。人类基因组计划的成果体现在人类基因组遗传图，物理图和序列图的完成，而基因图的完成还有待大量的工作。 后基因组计划（PGP）是在HGP的人类结构基因组学成果基础上的进一步探索计划，将主要探讨基因组的功能，即功能基因组学研究。由此派生了蛋白质组学，疾病基因组学，药物基因组学，环境基因组学等分支研究领域，同时也促进了比较基因组学的展开。后基因组计划研究的进展，促进了生命科学的变革，可以预见会对医学、药学和相关产业产生重大影响。 HGP的成就加速了基因定位研究的进展，也提高了基因克隆研究的效率。基因的定位与克隆是完成人类的基因图，进而解码每一个基因的结构和功能的基本研究手段。 一、基本纲要 1.掌握基因组，基因组学，结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学,基因组医学, 后基因组医学的概念。 2.熟悉人类基因组计划（HGP）的历史，HGP的基本目标；了解遗传图，物理图，序列图，基因图的概念和构建各种图的方法原理。 3.了解RFLP，STR和SNP三代DNA遗传标记的特点。 4.熟悉后基因组计划（PGP）的各个研究领域即功能基因组学、蛋白质组学、疾病基因组学、药物基因组学，比较基因组学、生物信息学等的概念和意义。
【免费下载】真菌基因组学研究进展
真菌基因组学研究进展 真菌为低等真核生物，种类庞大而多样。据估计，全世界约有真菌150万种，已被描述的约8万种。真菌在自然界分布广泛，存在于土壤、水、空气和生物体内外，与人类生产和生活有着非常密切的关系。许多真菌在自然界的碳素和氮素循环中起主要作用，参与淀粉、纤维素、木质素等有机含碳化合物及蛋白质等含氮化合物的分解。有些真菌如蘑菇、草菇、木耳、麦角、虫草、茯苓等可直接供作食用和药用，或在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用。然而，也有些种类引起许多植物特别是重要农作物的病害，如水稻稻瘟病、小麦锈病、玉米腥黑穗病、果树病害等。少数真菌甚至是人类和动物的致病菌，如白色假丝酵母Candida albicans等。因此，合理利用有益真菌，控制和预防有害 真菌具有重要意义。 本文整理了已完成基因组序列测定的真菌的信息，并对真菌染色体组的历史、测序策略及其基因组学的研究进展进行了评述。 1真菌染色体组的研究历史和资源 1986年美国科学家Thomas Rodefick提出基因组学概念，人类基因组计划带动了模式生物和其它重要生物体基因组学研究。阐明各种生物基因组DNA中碱基对的序列信息及破译相关遗传信息的基因组学已经成为与生物学和医学研究不可分割的学科。由欧洲、美国、加拿大和日本等近百个实验室六百多位科学家通力合作，1996年完成第一个真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组测序，这 对于酵母菌类群来说是一个革命性的里程碑，并且激起了真核基因功能和表达的第一次全球性研究(Goffeau etal，1996)。随后粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(Wood etal.2002)和粗糙脉孢 霉Neurospora crassa(Galagan etal.2003)染色体组的完成显露出酿酒酵母作为真菌模式生物的局限性。尽管如此，真菌染色体组测序的进展最初是缓慢的。为加快真菌染色体组研究的步伐，2000年由 美国Broad研究所与真菌学研究团体发起真菌基因组行动(fungal genome initiative，FGI)，目的是 促进在医药、农业和工业上具有重要作用的真菌代表性物种的基因组测序。2002年2月FGI发表了第 一份关于测定15种真菌基因组计划的白皮书。2003年6月，真菌基因组行动发表了第二份白皮书，列 出了44种真菌作为测序的目标，强调对其中10个属即青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、组 织胞浆菌属Histoplasma、球孢子菌Coccidioides、镰刀菌属Fusarium、脉孢菌属Neurospora、假丝 酵母属Candida、裂殖酵母属Schizosaccharomyces、隐球酵母属Cryptococcus和柄锈病菌属Puccin& 的物种优先进行测序。之后，经过FGI、法国基因组学研究项目联(G6nolevures Consortium)、美国能 源部联合基因组研究所(The DOE Joint Genome Institute，JGI)DOE联合基因组研究所、基因组研究 院(The Institute for Genomic Research，TIGR)、英国The Wellcome Trust Sanger InstimteSanger和华盛顿大学基因组测序中心等共同努力；得到包括美国国家人类染色体研究所、国 家科学基金会、美国农业部和能源部等的资助，也有来自学术界和产业集团如著名的 Monsanto、Syngenta、Biozentrum、Bayer Crop Science AG和Exelixis等公司的持续合作，在最近 的几年里，真菌基因组学研究取得重大突破。至2008年6月1日，共有3734种生物的全基因组序列测定工作已经完成或正在进行，公开发表812个完整的基因组，其中，70余种真菌基因组测序工作已经 组装完成或正在组装，分别属于子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和微孢子虫(Microsporidia) 的代表。此外，还有Ajellomyces dermatitidis和Antonospora locustae等20余种真菌基因组序列 正在测定中(Bemal etal．2001)。这些真菌都是重要的人类病原菌、植物病原菌、腐生菌或者模式生物，基因组大小为2．5—81．5Mb，包含酵母或产生假菌丝的酵母、丝状真菌，或者具有二型性(或多型性) 生活史的真菌，拥有与动物和植物细胞一样的的细胞生理学和遗传学特征，包括多细胞性、细胞骨架结
人类基因组计划.doc
【篇一】人类基因组计划随着人类基因组计划的完成 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范
水稻基因组进化的研究进展
水稻基因组进化的研究进展 水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻是第一个被全基因组测序的作物，目前栽培稻2个亚种全基因组测序工作已经完成：粳稻品种日本晴(Nipponbare)通过全基因组鸟枪法和逐步克隆法被测序，籼稻品种扬稻6号(9311)通过全基因组鸟枪法被测序。除核基因组外，水稻叶绿体和线粒体基因组也于1989年和2002年分别被测序。水稻2个亚种的全基因组测序完成，一方面开启了植物比较基因组学的大门，另一方面为人们在基冈组水平上鉴定出所有水稻基因并分析其功能奠定了基础，同时也使得人们对植物进化的认识，尤其是对禾本科植物进化的了解，逐步从系统分类和分子标记水平进入到了基因组序列水平。许多研究者通过对水稻基因组序列的分析，利用生物信息学工具，对水稻在基因组水平上的进化进行了大量研究。 1 水稻及其他禾本科植物基因组的古多倍体化过程 水稻是典型的二倍体植物，其核基因组中共有12条染色体。在水稻基因组被完整测序之前，人们就已经采用分子标记、DNA重复元件等方法探究水稻基因组的古多倍体化(polyploidization)过程，并发现了一些重复的染色体片段。随着水稻基因组测序计划的完成，越来越多的证据表明水稻基因组曾发生过全基因组复制(whole genome duplication)，即古多倍体化过程。 Golf等利用鸟枪法完成了粳稻品种日本晴全基因组的测序工作，并利用同义替换率分布方法(Ks- based age distribution)提出水稻基因组可能发生过一次全基因组复制过程。此后多家研究机构和一些研究者对水稻基因组中的重复片段进行了研究，虽然得出的结论不尽相同，但均发现水稻基因组中存在大量的重复片段。根据所采用方法和参数的不同，这些重复片段占整个水稻基因组的15％～62％。Yu 等在水稻基因组中发现了18对大的重复片段，大约占整个基因组的65．7％。其中17对重复片段形成的时间很相近，发生在禾本科物种分化之前；最近的一次片段复制事件发生在水稻11和12号染色体之间，在禾本科物种分化之后。 水稻基因组被测序之后，许多科研机构对基因组数据进行了详尽的注释。其中应用比较广泛的是美国基因组研究院(the institute for genome research，TIGR)和日本农业生物科学研究所(national in- stitute of agrobiological sciences，NIAS)的水稻基因组注释信息。TIGR根据其注释的结果和基因相似性矩阵(gene homology matrix，GHM)方法，检测到大量染色体间的重复片段，这些重复片段几乎覆盖了整个水稻基因组。TIGR水稻基因组注释数据库从第4版开始便增加了对片段重复的注释，该分析是利用DAGChainer程序进行的，重复片段采用100 kb和500 kb 2种参数模型进行了染色体片段的基因共线性分析(图1)，这是全基因组复制的有力证据。根据复制片段上同源基因的分子进化分析，估计全基因组复制发生在大约7 000万年前，在禾本科物种分化之前。此外，Zhang等利用TIGR更新的数据进行分析，采用同义替换率分布方法检测到另一次更古老的(单、双子叶植物分化前)基因组复制事件，说明水稻基因组至少经历了2次全基因组复制过程。 全基因组复制或多倍体化是植物尤其是禾本科作物物种形成和进化过程中非常重要的事件，大部分开花植物在进化过程中均经历了多倍体化过程。基因组加倍后，再经历所谓的二倍体化过程(diploidization)，进化成当代的二倍体物种，并造成大量重复片段中基因的重排和丢失。Salse等研究发现基因组复制事件对禾本科植物的物种形成和演变具有重要作用。他们认为禾本科植物的祖先物种是一个基因组内包含5条染色体的物种，在进化过程中，首先在距今5 000～7 000万年前经基因组复制产生了10条染色体；此后，在基因组内发生了2次染色体置换和融合而形成了12条中间态染色体。以这12条中间态染色体为基础，逐渐分化出水稻、小麦、玉米和高粱的基因组，其中水稻基因组保留了原有的12条中间态染色体，而小麦、玉米和高粱均又发生了染色体丢失和融合才形成了现有的基因组。水稻全基因组复制片段是至今为止在动、植物基因组中发现的最为清晰、完整的基因组复制的遗迹。水稻之所以保存这么完整，一方面是水稻基因组保持了12条中间态染色体的基本形态，另一方面可能与水稻基因组相对较稳定有关。 2水稻籼粳2个亚种的分化 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11 500多年的栽培历史中，因适应不同的农业生态环境而产生了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化。长期以来，基于形态性状、同工酶以及对一些化合物不同反应的研究，把亚洲栽培稻(Oryza sativa L．)分为籼稻(indica)和粳稻(japonica)2个亚种。其中籼亚种耐湿耐热，主要适应于热带和亚热带等低纬度地区，而粳亚种则耐寒耐弱光，适应于高纬度和高海拔地区种植。这2个亚种间不仅产生了生殖隔离的基因库，还在形态特征、农艺性状和生理生化反应等方面存在明显的差异。近期群体
发现毒理学的研究进展
*基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)基金(2002AA2Z342D 和2004A A2Z3774) 综 述 发现毒理学的研究进展 * 王全军,吴纯启,廖明阳 (军事医学科学院毒物药物研究所,国家北京药物安全评价研究中心,北京100850) [摘要] 发现毒理学又称为开发前毒理学(Predevelopmental Toxicology),是指在创新药物的研发早期,对所合成的系列新化合物实体(New Chemical Entities,NCEs)进行毒性筛选,以发现和淘汰因毒性问题而不适于继续研发的化合物,指导合成更安全的同类化合物。发现毒理学的研究既可加快药物研发进程,提高研发成功率,又减少资源消耗。笔者就发现毒理学研究的定义、必要性、研究内容、研究方法和我国当前的研究现状作一简述。 [关键词] 发现毒理学;新化合物实体(NCEs);毒性筛选 [中图分类号]R994 1;R965 1 [文献标识码]A [文章编号]1003-3734(2005)08-0958-04 Progresses of discovery toxicology research W ANG Quan jun,W U Chun qi,LI AO Ming yang (Institute o f Pharmacology and To xicology ,Academ y o f Military Medical Sciences ,National Beijing Center f o r Drug Sa fety Evaluation and Research ,Beijing 100850,China )[Abstract ] Discovery toxicology,also named predevelopmental toxicology,is to screen toxicities of new che mical entities (NCEs)in the discovery phase of ne w drug research,to discover and eliminate the compounds that are unsuitable for further development due to their toxicity as early as possible,and to optimize the next more safe compounds.Discovery toxicology research can break through the limitation and improve the efficiency of drug research.This article will present the concept of discovery toxicology,the essentiality of discovery toxicology research.The content,methods and current status of discovery toxicology in China are described too. [Key words ] discovery toxicology;new chemical entities(NCEs);toxicity screening 药物研发成功与否部分取决于在研发早期严格淘汰不适合进一步研发的化合物。在药物临床前阶段,毒性问题是研发失败的主要原因。在研发早期尽早发现候选化合物的潜在毒性是毒理学研究的重要问题。 多年来,新药研发越来越多地依赖于生命科学技术的研究进展。在新药设计方面,化学家参考药物作用靶、内源性配体和底物的化学结构特征,应用计算机辅助药物设计手段发现选择性作用于靶位的新药;在新药活性筛选方面,现代药物组合化学与体外高通量筛选的成功结合极大地提高了先导化合物的发现速度;在新药的药动学(ADME)研究方面,多种基于药物代谢酶或转运体的药动学筛选模型已开始应用于新药开发研究。这些新技术的成功运用大 大加快了药物研发早期的药物发现、药物合成、药效筛选的进程,从而产生大量的候选化合物。传统药物毒理学研究在时间、经费、样品消耗量和动物数等方面都花费巨大,在药物毒作用机制研究方面难以阐明一些临床使用药物的毒性机制和理想的应急解毒措施,因此传统药物毒理学无法满足因新的生物技术而产生的海量候选化合物的毒性筛选研究,成为限制整个药物研发的瓶颈。而发现毒理学(Discovery Toxicology)的研究将打破这个瓶颈,既可加快药物研发进程,提高研发成功率,又减少资源消耗。笔者就发现毒理学研究的含义、必要性、研究内容、研究方法和我国当前的研究现状作一简要综述。1 定义、产生背景和产生的必要性 伴随着科学技术的发展,当代毒理学的发展将 958
第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学
第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 测试题 一、名词解释 1．分子杂交 2．Southernblotting 3．Northernblotting 4．Westernblotting 5．dotblotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能性克隆 9．转基因技术 二、填空题 1．Southernblotting用于研究、Northernblotting用于研究，Westernblotting用于研究。 2．PCR的基本反应步骤包括、和三步。 3.在PCR反应体系中，除了DNA模板外，还需加入、、和。 4．Sange法测序的基本步骤包括、、和。 5．目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。 6．血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是，而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。 三、选择题 A型题 1.经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是： A．SouthernblottingB．Northernblotting
C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 2.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Dotblotting E．insituhybridization 3.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB.Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 4.经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Easternblotting E．insituhybridization 5.PCR的特点不包括 A．时间短，只需数小时B．扩增产物量大 C.只需微量模板D．用途非常广泛 E.底物必须标记 6．用于PCR的DNA聚合酶必须 A．耐热B．耐高压C.耐酸D．耐碱E.耐低温7．PCR反应过程中，模板DNA变性所需温度一般是A．95?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 8．PCR反应过程中，退火温度一般是 A．72?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 9.PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是A．95?CB.82?CC．72?CD．62?CE．55?C
进化基因组学研究进展
进化基因组学研究进展 刘超 （山东大学生命科学学院济南250100） 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 前言 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学(Evolutional Genomics)。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 1进化基因组学研究内容 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。
目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面[2]（如图1）。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学[2]、基因注释的等方面；在新基因方面主要分析基因产生机制和新基因固定及其动力学研究。 图1 进化基因组学主要研究内容 目前进化基因组学的研究有力的解决了一些基础性的进化问题，但也出现了一些未来需要急需解决的挑战。例如生物进化的本质和目前重建系统进化树方法的限制[1]。 2研究进化基因组学的方法 研究进化基因组学的方法主要包括利用基因组数据分析和研究新基因的产生和演化两种。 2.1利用基因组数据进行系统进化分析 利用基因组数据进行系统进化分析，常有基于基因序列的方法和基于全基因特征的方法。（如图2）
系统毒理学及其研究进展
系统毒理学及其研究进展 在总结国内外相关研究的基础上，综述了系统毒理学的原理、诞生背景、研究策略、研究基础及其主要应用。同时，通过介绍系统毒理学的研究实例来阐述其目前的研究进展情况。希望从分子生物学的发展中汲取足够营养并结合传统毒理学的研究成果发展壮大自己。 【Abstract】Based on the foundation of related research at home and abroad，paper summarizes the principle and research strategy，research background，basis and main application of system toxicology. At the same time，to explain its current status a case study of the system is introduced. And we hope to draw sufficient toxicological nutrition from the development of molecular biology and development itself combined with the research of traditional toxicology . 标签：背景；技术；应用；进展 1 系统毒理学及其诞生背景 系统毒理学是近10年来发展起来的一门新兴学科，代表着后基因组时代毒理学发展的新方向。所谓系统毒理学是指通过了解机体暴露后在不同剂量、不同时点的基因表达谱、蛋白质谱和代谢物谱的改变以及传统毒理学的研究参数，借助生物信息学和计算毒理学技术對其进行整合，从而系统地研究外源性化学物和环境应激等与机体相互作用的一门学科[1]。 近年来，生命科学在新理论和新技术上有了突飞猛进的发展，一系列“组学”（omics）应运而生，如基因组学（genomics）、蛋白质组学（proteomics）、细胞组学（cellomics或cytomics），等新学科不断涌现，使人们对基因和基因组的认识，对生命本质的认识和认识生命、健康的手段取得了重要的进展。 另外，传统的毒理学研究依然存在许多不足，相对于飞速发展的分子生物学技术和越来越多的外源性物质，毒理学的研究方法急待革新。 系统毒理学的发展，既有系统生物学发展的外在刺激，又有传统毒理学在发展中克服自身不足的内在需求。 2 生物学基础 2.1 基因组学 基因组学是研究基因组的结构、功能及表达产物的学科。基因组的产物不仅是蛋白质，还有许多复杂功能的RNA。将基因组学的方法与技术应用于毒理学研究领域，称之为毒物基因组学（toxicogenomics）。毒物基因组学的基本方法是通过观察生物在接触毒物后基因表达谱的变化，筛选毒性相关基因、揭示毒作用
基因组学研究的应用前景
基因组学研究的应用前景摘要：基因组学是一门研究基因组的结构，功能及表达产物的学科，基因组的结构不仅是蛋白质，还有许多复杂功能的RNA,包括三个不同的亚领域，及结构基因组学，功能基因组学和比较基因组学。近几年，基因组学在微生物药物，细菌，病毒基因，营养基因方面都有进展，其前景是光明的。 关键词：基因研究未来结构 一、微生物药物产生菌功能基因组学研究进展 微生物药物是一类化学结构和生物活性多样的次级代谢产物，近年来多个产生菌基因组序列已经被测定完成，在此基础上开展的功能基因组研究方兴未艾，并在抗生素生物合成，形态分化，调控，发育与进化及此生代谢产物挖掘等方面有着新的发现，展现出广阔的研究前景，青霉素及其衍生的《》内酰胺类抗生素极大地改善了人类的卫生保健和生活质量，并促进研究人员不断对其工业生产菌株类黄青霉进行遗传改良和提高其产量，从而降低生产成本。经过60年的随机诱变筛选，当前青霉素产量至少提高了三个数量级，同时，青霉素的生物合成机理也得到了较为清晰的阐述，其pcbAB编码的非核糖体肽合酶ACVS~DPcbc编码的异青霉素N合成酶IPNS位于细胞质中，而苯乙酸COA连接酶PenDE编码的IPN酰基转移酶位于特殊细胞器一微体中。 研究发现，青霉素合成基因区域串联扩增，产黄青细霉胞中微体含量增加都可显著提高青霉素产量。然而随机诱变筛选得到的黄青霉工业菌株高产的分子机制尚不明确。为此，2008年荷兰研究人员联合国美国venter基因组研究所对黄青霉wisconsin54—1225进行了基因组测试和分析，并进一步利用DNA芯片技术研究了wisconsin54—1255及其高产菌株DS17690在培养基中是否添加侧链前体苯乙酸情况下的转录组变化，四组数据的比较分析发现，有2470个基因至少在其中一个条件下是差异表达的，根据更为严格的筛选标准，在PPA存在的条件下，高产菌相比测序菌株有307个基因转录是上调的，和生长代谢，青霉素前体合成及其初级代谢和转运等功能相关，另有271个基因显著下调，主要是与生长代谢及发育分化相关的功能基因。 二、乳酸菌基因组学的研究进展
叶绿体系统发育基因组学的研究进展
叶绿体系统发育基因组学的研究进展* 张韵洁，李德铢＊＊ （中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室，云南昆明650201） 摘要：系统发育基因组学是由系统发育研究和基因组学相结合产生的一门崭新的交叉学科。近年来，在植物系统发育研究中，基于叶绿体基因组的系统发育基因组学研究优势渐显端倪，为一些分类困难类群的系统学问题提出了解决方案，但同时也存在某些问题。本文结合近年来叶绿体系统发育基因组学研究中的一些典型实例，讨论了叶绿体系统发育基因组学在植物系统关系重建中的价值和应用前景，并针对其存在问题进行了探讨，其中也涉及了新一代测序技术对叶绿体系统发育基因组学的影响。 关键词：系统发育基因组学；叶绿体基因组；新一代测序技术；长枝吸引 中图分类号：Q75，Q949文献标识码：A文章编号：2095－0845（2011）04－365－11 Advances in Phylogenomics Based on Complete Chloroplast Genomes ZHANG Yun-Jie，LI De-Zhu＊＊ （Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography，Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming650201，China） Abstract：Phylogenomics is a new synthesized discipline which combines genomics with phylogenetics．Phylogenom-ics based on chloroplast genomes has shown many great advantages in plant phylogenetic research in recent years，providing resolutions for phylogeny of some taxonomically difficult groups of plants．However，there are some prob-lems coming along with chloroplast phylogenomics as well．In this review，the application prospects and potential problems of chloroplast phylogenomics in plant phylogenetic reconstruction were discussed based on recent phylog-enomic case studies．The influence of next-generation sequencing on chloroplast phylogenomics was also discussed．Key words：Phylogenomics；Chloroplast genome；Next-generation sequencing；Long-branch attraction 地球上的生命形式多种多样，它们因有着共同的进化历史而有着或近或远的渊源。正确理解不同生物类群之间的关系不仅是进化生物学研究的前提，生物分类和命名的依据，而且也是开展生物学其它分支学科研究的基础。因而构建可靠的系统发育树（即将各生物类群之间的关系形象地以树的形式描绘出来）不仅是系统发育研究的重点，也是生物学研究的重要内容之一。早期系统发育学家通过对化石记录、比较形态学和比较生理学的研究，构建出了物种进化历史的主要框架（Nei和Kumar，2000）。20世纪80年代以后，随着分子生物学的快速发展，系统发育研究开始由比较形态学转向分子系统学研究领域，即利用生物大分子（如DNA序列、氨基酸序列等）所提供的信息来推断生物的进化历史（Li和Olmstead，1997；Nei和Kumar，2000；田欣和李德铢，2002）。分子系统学研究的出现使我们对生命进化过程有了更深刻的认识。然而随着分子证据的不断积累，基于不同分子片段对同一类群所进行的分子系统学研究结果之间存在的差异， 植物分类与资源学报2011，33（4）：365 375 Plant Diversity and Resources DOI：10．3724/SP．J．1143．2011．10202 ＊＊＊基金项目：中国科学院现代农业科技创新基地重要方向性项目“重要野生禾本科植物的比较基因组学和重要功能基因的研究（KSCX2-YW-N-029）” 通讯作者：Author for correspondence；E-mail：dzl@mail．kib．ac．cn 收稿日期：2010－11－15，2010－12－01接受发表 作者简介：张韵洁（1984－）女，在读硕士研究生，主要从事植物系统发育基因组学研究。
镉的毒性和毒理学研究进展
2Chin J Ind Hyg Occup Dis,Febru ary1998,Vol.16,No.1 述 评 镉的毒性和毒理学研究进展 刘杰 镉(Cadmium)是一种重金属,它与氧、氯、硫等元素形成无机化合物分布于自然界中。镉对人体健康的危害主要来源于工农业生产所造成的环境污染。镉对肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性,被美国毒物管理委员会(ATSDR)列为第6位危及人体健康的有毒物质。环境中的镉不能生物降解,随着工农业生产的发展,受污染环境中的镉含量也逐年上升。镉在体内的生物半衰期长达10～30年,为已知的最易在体内蓄积的毒物。镉在肾脏的一般蓄积量与中毒阈值很接近,安全系数很低。在60年代提出了镉污染与日本“痛痛病”的因果关系后,环境中的镉与健康关系的研究日益受到重视。近几年来,有关镉毒理学研究的文献每年超过600篇(Medline检索)。美国目前有大约100个关于镉与健康的研究课题,涉及各个领域。国内对镉的毒性和毒理学的研究开展得也比较广泛,其中一些在中毒机制方面作了较深入的探讨,有的学者甚至进行了长达十几年的研究。 镉的毒性和毒理学研究进展主要包括以下几个方面: 一、镉污染与人类健康 1.环境中的镉:对环境中镉污染的早期关注局限于锌、铜、铅矿的冶炼。后来注意力转为镉在工业中的应用,如电池、电镀、合金、油漆和塑料等工业。经过多年的努力,国内外对职业劳动中接触镉的卫生保护已大大加强。近年来,对环境中的镉通过食物链对一般人群的潜在危害已受到高度重视。随着含镉磷肥的施用、污水灌溉等,土壤中镉含量增加,继而被某些植物摄取而进入食物链。1997年国际地球生化学会在美国加州专门对此问题进行了讨论并出版了专著;国际环境科学委员会(SCOPE)则进一步将土壤中镉的来源、价态、食物链中的转化以及对一般人群健康的影响定为目前镉研究的一个重点方向。 2.镉的摄入及监测:职业人群镉暴露的主要途径是吸入。对作业场所空气中镉的浓度进行监测并控制在容许范围之内,是保护工人健康的一个重要手段。对一般人群来说,镉暴露主要来源于食物和吸烟。人们每日可从食物中摄镉30～50 g,但仅有1%～3%被肠胃吸收。因此,对镉的胃肠吸收、体内分布和排泄的影响因素一直是镉毒理学研究中的一个热点。其中,镉与金属硫蛋白(m etal-lothio nein,MT)的结合,及镉与锌、钙的相互作用是影响镉体内代谢动力学的重要因素。血镉的含量可用来评价近期的镉暴露,尿镉含量则在一定程度上反映了镉性肾损伤和体内的镉负荷。尿中的 2-微球蛋白和尿M T的含量已作为镉暴露的生物标志物。 二、镉的毒性研究进展 1.镉的肾毒性:肾损伤是慢性染镉对人体的主要危害。一般认为镉所致的肾损伤是不可逆的,目前尚无有效的疗法。很多学者认为:镉所致的肾损伤是由在肝脏形成的镉-金属硫蛋白(M T)复合物(CdM T)引起的。因此,一次性大量注射CdMT造成肾损伤的动物模型用来研究镉的肾毒性机制已达20年之久。最近,用删除了M T的转基因动物的实验结果表明:镉所致的肾损伤并不一定依赖于CdM T的形成,无机镉亦能直接造成肾脏损伤。一次性注射CdM T主要造成肾小管细胞的坏死,而慢性染镉造成的病理改变则波及整个肾脏,包括肾小球的损伤和肾间质的炎症。慢性染镉 作者单位:66160美国堪萨斯城,堪萨斯大学医学中心药理毒理系
人类基因组计划论文
人类基因组计划的重要性 “以破解人类遗传和生老病死之谜，解决人类健康问题为目的的人类基因组计划，对人类自身的生存和发展具有重要的意义。其旨在通过测定人类基因组DNA约3×109对核苷酸的序列，探寻所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，明确所有基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面认识自我。” 基因作为掌控人类自身性状、特征和遗传的根本因子，以其简单的双螺旋结构、复杂的排列方式，使全世界范围内的每一个人类都有着相同的本质和不同的特质。基因的轰动范围极为广泛，我们身上的每一处体态特征几乎都由基因所决定，大到一个人的身高、外貌，小到一颗牙形的状，甚至是一根头发的直径都与基因有着密不可分的联系。众所周知，基因由五种碱基对以庞大的数量按一定顺序排列组合而成，其本质是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。在一个活跃的细胞内，特定的基因通过解旋、转录、翻译等一系列过程，来实现RN A、蛋白质等相应物质的合成，这些数以万计的不同形态不同功能的RN A、蛋白质在细胞内外发挥出他们自身的作用，从而达到控制人类机体、完善结构功能、协调组织器官运作的神奇效果。 由以上的事实我们可以看出，要想解开人类自身的秘密，就要从破解基因的密码做起。 人类基因组计划便应运而生了。该计划是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波1罗计划并称为三大科学计划。 “HDP（人类基因组计划）的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。”