金银花中绿原酸的提取与分离
现代分离技术实验安排
一、实验说明
1、本课程实验为一次性综合大实验，采取分班进行，每班实验必须在连续两天内
完成，各组的实验安排均为周六和周日的上午8点到晚上的8点。
每次实验1个班，每个实验由两个人共同完成，即两人一组，每组一套实验仪器和一张实验台。每班的班长负责实验室的卫生和安全。
2、课程考核方法采用实验考察形式进行，每人只安排一次实验机会，过期不补，希
望各位同学能够按时参加。若有冲突，学生之间可相互对调。
3、进入实验室后，各组同学首先按照仪器清单检查仪器的数量和完好情况。若有
仪器短缺或破损等问题，请在上课后20分钟内与实验室工作人员及时联系，并要求实验人员进行补充或更换。
4、实验结束后，各组同学应对照仪器清单检查，分别洗净后交实验人员验收。如
有损坏或缺少，应按规定缴纳赔偿金。因此，希望同学们爱惜仪器，认真操作。
实验期间，应注意保持实验室台面、地面和水槽的卫生，尤其是自己的工作区域。同时应注意实验室的财产安全和自身安全，不可在实验室喧哗吵闹。
二、实验内容
题目：金银花中绿原酸的提取与分离
学习内容：固体中有效成分的提取（索氏法）技术；
减压浓缩（旋转蒸发）技术；硅胶吸附柱层析；
硅胶吸附TLC技术；薄层色谱对产品纯度检测
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药
食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病
发热、急性支气管炎、肺炎、腮腺炎、胆道感染、关节炎等，能改善放、化疗所
致的白细胞降低，有“中药中的青霉素”的美誉。另外，金银花还被广泛地应用
于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活
性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的
优劣。
绿原酸结构式
HO HO
O
O
2'
3'
4'5'6'
8'
9'OH
HO OH OH
O 1
2
3
4567'
1'
三、实验方案 四、方法
1、TLC 板的制备与活化
在干净的研钵内加入约6g 硅胶GF254，在轻轻研磨的同时缓慢加入15ml 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液。继续研磨约10min ，当体系粘稠度适宜时，即可进行铺板。
用药匙将适量糊状物均匀摊在干净干燥的载玻片上，然后用手拿住薄板的一
含绿原酸的洗脱液
浓缩至干
绿原酸粗品
绿原酸
硅胶柱
氯仿－甲醇梯度洗脱
端在台面上轻轻振动，直至薄层均匀为止。将铺好的薄板平放在水平的台面上，凉干。
将凉干后的薄板放入预先恒温到105～110℃的烘箱中活化30min。
2、提取（索氏法）
将金银花制成粗粉，称取约100g，用75%乙醇采用索氏提取器回流处理4h，其提取液减压浓缩、60℃干燥得浸膏。
3、分离
（1）粗分离
取一定量浸膏，按1∶1加入200-300目硅胶拌样，晾干。
用乙酸乙酯湿法装柱（柱型?8.5cm×53cm，硅胶200-300目），干法上样，柱体依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）、甲醇洗脱。流速控制在每1/10柱体积即可。分部收集，每管30ml。
（2）粗分离过程中薄层检测
粗分离过程中对柱子的洗脱情况随时进行薄层检测，展开剂为乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。从某个馏分开始有绿原酸出现（λ365nm下显兰色荧光）至几乎看不到兰色荧光，显示绿原酸已基本收集完全。结合显色剂显色，将相同流分合并，共分26个部分。其流程图：
浸膏拌样
A1......A4
图2金银花粗分流程图
具体方法：
收集液的薄层预检：在对各收集管进行TLC分析之前，为了节约薄板，可用毛细管将各收集管中的液体依次在一块薄板上并对各点样按照相应的管号一次编号，等样点上的溶剂彻底挥发干后，置于波长365nm的紫外灯下观察，有明显斑点的表明其对应接受管中含有化合物，没有斑点的表明对应管中没有化合物。然后再对有斑点的各管按照下法进行TLC分析。
TLC分析：用事先活化好的薄层板对每管收集液进行TLC分析，点样数视板
的大小而定，每两斑点之间最小间距不少于8mm，其中有一个为绿原酸对照点（注意：每个毛细管只能用于同一个样品；每个试管的点样量应相同；点样时应按管号依次进行；每个TLC分析的薄层板应依次编号）。等展开剂爬行到板层4/5～5/6高度时，取出薄层板，室温平放或平放于暖气片上，让溶剂挥发干。然后将薄板置于波长365nm下，观察和记录薄板上斑点的分布情况及其对应的Rf值。
TLC分析内容如下：
判断斑点数的多少。展开后，斑点数多表明所含化合物越多。只有一个斑点者表明对应管中可能含有纯化合物。斑点颜色越深表明所含对应化合物的量越多。
根据R f值或斑点高度判断不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑点，表明两管含有相同的成分。
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品。
（3）精制
B5和C1部分经TLC检测含有大量的绿原酸，两部分合并（B5C1）浓缩至干后得绿原酸粗品，该部分再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得一化合物（E），即为绿原酸精品。
4、检测
对B5C1和E两部分分别进行高效液相色谱分析，检测两部分的绿原酸含量。
测定条件：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，SPD-10A V紫外检测器，以乙腈－0.4%磷酸（13:87）为流动相，327nm下检测。
附：试验主要用品
1 材料
金银花（为金银花花蕾和开放花的混合样品，经烘房烘干后，备用。）
2试剂
本实验所用有机、无机试剂均为分析纯。
薄层层析硅胶：GF254和硅胶G，化学纯
柱层析硅胶：硅胶G（粒度100-200目）
3主要仪器
旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、三用紫外仪、电子分析天平、高效液相色谱仪。
金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究
第20卷第2期2005年6月 天津科技大学学报Journal of Tianjin University of Science &Technol ogy Vol .20 No .2 Jun . 2005 金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究 3 张泽生,乌 兰 (天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300222) 摘 要:用紫外光谱法(UV )和高效液相色谱法(HP LC )对金银花中提取的绿原酸进行定性 定量分析,测定了绿原酸对食品中常见的致病菌的抑菌能力,清除DPPH ?自由基的能力和对Fe 3+的还原能力。结果表明:金银花中绿原酸具有较强的抑菌效果,对自由基有较强的清除能力,对Fe 3+有较强的还原能力。关键词:金银花;绿原酸;抑菌;抗氧化 中图分类号:TS207.3 文献标识码:A 文章编号:167226510(2005)022******* An ti m i crob i a l and An ti ox i da ti on I nv itro of Chlorogen i c Ac i d i n F los L on icerae ZHANG Ze 2sheng,W U Lan (College of Food Engineering and B i otechnol ogy Tianjin University of Science &Technol ogy,Tianjin 300222,China ) Abstract:Quantative and qualitative analysis of chl or ogenic acid in Flos L onicera were devel oped by UVand HP LC .Detect the bacteri ostatic acti on against pathogenic bacteria in diets ,the capacity of eli m inating DPPH ?and deoxidizing Fe 3+ .The results suggested that chl or ogenic acid has a str ong antibacterial acti on,a superi or capacity of eli m inating DPPH ?and deoxidizing Fe 3+ .Key words:Flos L onicerae ;chl or ogenic acid;bacteri ostatic acti on;anti oxidati on 金银花在我国分布广,药用历史悠久,是常用的清热解毒药。金银花为忍冬科(Caprifoliaceae )忍冬属(L on icera )植物忍冬(L onicera japonica thunb )及同属多种植物的干燥花蕾,是临床常用的中药之一。近年来研究发现,金银花中富含多种对人体健康有益的物质,诸如挥发油黄酮及绿原酸类、三萜类和微量元素等,具有很高的利用价值。在众多的成分中绿原酸较为丰富且具有多种活性功能,因此常以绿原酸含量的高低评价金银花质量的优劣[1] 。 绿原酸是一种含有酚羟基的化合物,药理学证明, 绿原酸具有保护心血管的活性[2] 。人体内的低密度脂蛋白(LDL )被氧化是引起心血管病的一个重要原因[3] 。绿原酸能有效地保护人体LDL 中α2Tocopher 2ol,使其LDL 免受氧化 [4]。当人体摄入一定量含有酚羟基化合物的食物时,这些物质可降低或淬灭人体中自由基的产生。据统计在心脏病低发病率的人群中,发病率与绿原酸的摄入有一定联系,其部分抗病机制是绿原酸对人体LDL 中α2T ocopher ol 氧化的抑制作用[5] 。 本文在对金银花中绿原酸的抗菌、抗氧化活性等方面做一些探讨,为工业化生产该类物质提供一定的技术依据。 1 材料和方法 1.1 材料与仪器1.1.1 试验材料 河南产金银花,经干燥后破碎。 3 收稿日期:2004211202 33基金项目:天津市教委科研基金资助项目(20039902) 33作者简介:张泽生(1956-),男,天津市人,教授,博士生导师;研究方向:食品营养、天然产物开发与研究. E 2mail:zhangzesheng@hot m ail .com.
金银花中绿原酸的提取
金银花中绿原酸的提取、分离纯化 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸 过程中经莽草酸途径代谢产生的苯丙素类化合物。化学结构为： 绿原酸 由结构可以看出它是含有羧基和邻二酚羟基的极性有机酸化合物，为酸性。由于分子内含有邻二酚羟基，受热、见光易氧化，因此供试液要在阴凉、避光下保存备用，且高温和长时间加热不利于绿原酸的提取。在碱性条件下，绿原酸易发生水解，植物体内存在的绿原酸往往是混合物而非单一组分。 绿原酸物理性质： 名称 分子式 分子量 性状 熔点 溶解度 绿原酸 C 16H 18O 9 345.30 半水化合物为针状晶（110℃变为无水化合物） 208℃ 水中4%，在热水中溶解度更 大，易溶于乙醇、丙酮和甲醇 等极性溶剂，难溶于氯仿、苯、 乙醚等亲脂性有机溶剂 一、实验目的： 1、了解金银花中有关成分，掌握绿原酸的相关性质，设计提取方案 2、掌握pH 梯度萃取法分离所需成分 3、掌握聚酰胺柱层析的方法 二、实验试剂、仪器 试剂：金银花，乙醇（70%、10%），盐酸（6mol/L ），乙酸乙酯，NaOH （5%），乙酸，聚酰胺，硅胶 仪器：冷凝回流装置，抽滤装置，旋蒸仪，分液漏斗，层析柱 三、绿源酸的提取、分离和纯化 （1）提取： 称取金银花50g 加入1000mL 的圆底烧瓶中，加入500mL （10倍量）70%的
乙醇，75℃冷凝回流3h，倒出液体，再用400mL（8倍量）、400mL（8倍量）回流两次，每次2h,过滤，合并滤液，然后80℃下浓缩滤液或者是用旋蒸仪旋干滤液至无醇味。 （2）分离纯化： ①取金银花提取浓缩液，以浓度6mol/L的HCl溶液调pH值至3.0左右，以3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液（乙酸乙酯层），以5%的NaOH溶液调萃取液pH至8.0左右，分取水层减压浓缩。 ②取金银花浓缩液，用聚酰胺拌样，用聚酰胺（80-100目）装柱（用量大概为绿原酸粗品的5倍），装入柱径与柱长比为1：7的层析柱中，常压下用10%的乙醇作为洗脱剂洗脱，收集流分，点样与标准品对照（标准品用50%的甲醇溶解，0.2mg/mL），合并相同流分，旋干即为所要提取的绿原酸。展开剂为乙酸乙酯：乙酸：水=2:1:1（硅胶色谱）。 (将相同流分合并后用乙酸乙酯重结晶能提高纯度)
金银花中绿原酸的提取及检测_乌兰.
下,随着球磨时间的增加,其剪切应力显著下降。 用幂方程τ=k γm (其中k 为稠度系数;m 为流动特征指数对曲线进行拟合,结果如表2所示。 由拟合结果可知,在不同温度下,相关系数R 2在0.9850~0.9993之间,这说明方程与曲线有较好的相关性。同一样品的稠度系数k 随着温度的升高而减小,说明温度升高可以减小体系的稠度,增强淀粉糊的流动性。在同一温度下随着球磨时间的增加,稠度系数k 显著下降,流动指数m 则是呈现增加的趋势,说明球磨后的绿豆淀粉更趋近于牛顿流体。 3结论 上述实验结果表明,机械球磨方法可以有效地将绿豆淀粉非晶化,球磨一定时间后淀粉颗粒的偏光十字消失,X -射线衍射曲线的尖峰衍射特征逐渐减弱,绿豆淀粉颗粒的结晶结构受到严重破坏。球磨处理后绿豆淀粉糊的流变特性在不同浓度和温度下发生了变化,绿豆淀粉糊随着球磨时间的延长稠度系数k 不断减小,而流动特征指数m 则不断增大,说明球磨处理后绿豆淀粉糊趋向于牛顿流体的特征。 参考文献:[1] Shinji Tamaki,Makoto Hismatsu,Katsunori Teranishi,et al.Structural change of maize starch granules by ball-mill treatment[J].S tarch,1998, 50(8:342-348.[2] Shinji Tamaki,Makoto Hisamatsu,Katsunori Teranishi,et al. Structural change of potato starch granules by ball-mill treatment[J].S tarch,1997,49(11:431-438.[3]胡飞,陈玲,李琳.马铃薯淀粉颗粒在微细化过程中结晶结构的变化[J].精细化工,2002,19(2:114-117. [4]
金银花中绿原酸的提取与分离
现代分离技术实验安排 一、实验说明 1、本课程实验为一次性综合大实验，采取分班进行，每班实验必须在连续两天内 完成，各组的实验安排均为周六和周日的上午8点到晚上的8点。 每次实验1个班，每个实验由两个人共同完成，即两人一组，每组一套实验仪器和一张实验台。每班的班长负责实验室的卫生和安全。 2、课程考核方法采用实验考察形式进行，每人只安排一次实验机会，过期不补，希 望各位同学能够按时参加。若有冲突，学生之间可相互对调。 3、进入实验室后，各组同学首先按照仪器清单检查仪器的数量和完好情况。若有 仪器短缺或破损等问题，请在上课后20分钟内与实验室工作人员及时联系，并要求实验人员进行补充或更换。 4、实验结束后，各组同学应对照仪器清单检查，分别洗净后交实验人员验收。如 有损坏或缺少，应按规定缴纳赔偿金。因此，希望同学们爱惜仪器，认真操作。 实验期间，应注意保持实验室台面、地面和水槽的卫生，尤其是自己的工作区域。同时应注意实验室的财产安全和自身安全，不可在实验室喧哗吵闹。 二、实验内容 题目：金银花中绿原酸的提取与分离 学习内容：固体中有效成分的提取（索氏法）技术； 减压浓缩（旋转蒸发）技术；硅胶吸附柱层析； 硅胶吸附TLC技术；薄层色谱对产品纯度检测 金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药 食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病 发热、急性支气管炎、肺炎、腮腺炎、胆道感染、关节炎等，能改善放、化疗所 致的白细胞降低，有“中药中的青霉素”的美誉。另外，金银花还被广泛地应用 于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活 性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的
金银花中绿原酸提取法
金银花中绿原酸提取法(索氏提取法为最佳提取方法) 1 . 1 主要材料与仪器 金银花( 购自药房) , 无水乙醇( AR ), 甲醇( A R 厂) , 乙酸乙酯( AR )。 索氏提取器(上海洪纪仪器设备有限公司),ESJ2 05 4型电子天平( 沈阳龙腾电子有限公司),UV 22 50 型紫外分光度计( 日本岛津) , 水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂) , KD M 型可调控温度电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司), 800 1 离心机(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司), K Q 50 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。 1 . 2 标准曲线的绘制 准确称取绿原酸对照品1 0 m g , 用60 %乙醇溶解并定容至50 m L ,备用.然后分别取0 . 0 、0 . 5 、1 . 0 、2 . 0 、3 . 0 、4 . 0 、5 . 0 mL , 再用60 %乙醇定容至50 mL以4号标准样在200 ~ 600 n m 波长范围内进行波长扫描, 测出绿原酸的最大吸收波长为326 n m。然后以60 % 乙醇作空白对照,测定每个标准样的吸光度( A ) 值。再以吸光度( A )值为纵坐标, 以标准样品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。得到回归方程y = 9 . 8019 x+ 0 . 0186R2= 0 . 999 3 。 1 ) 索氏提取法 干燥的金银花用研钵研碎, 称取10 g , 用滤纸包好, 置于索氏提取器中, 取有机溶剂80 mL , 先往索氏提取器中加70 % 的甲醇至与虹吸管相平, 剩余液体加入圆底烧瓶中, 对样品浸泡2 h , 然后在水浴锅上加热回流, 控制温度在70 左右, 虹吸5 次。把回流液倒于蒸馏瓶中进行减压蒸馏至30 mL , 超声溶解, 用0 . 25 u m 滤膜过滤, 测定其吸光度。 2 ) 超声波法 干燥的金银花用研钵研碎, 称取6 g , 置于锥形瓶中, 加入准确量取的100 mL 蒸馏水, 超声溶解,一段时间后过滤, 向滤渣中再加100 mL 蒸馏水,重复上述步骤, 把所得的滤液在离心机以3 000 r /m i n离心10 m i n .在把溶液进行减压蒸馏至30 mL ,得待测液, 测定其吸光度。 3 ) 水提法 干燥的金银花用研钵研碎, 称取6 g , 置于锥形瓶中, 加入准确量取的1 00 mL 蒸馏水, 水 浴加热,控制好温度, 一段时间后过滤, 向滤渣中再加100mL 蒸馏水, 重复上述步骤, 把所 得的滤液在离心机以3000 r /m i n 离心10 m i n 。在把溶液进行减压蒸馏至30 mL 得待测液, 测定其吸光度。