黄孢原毛平革菌低温产酶条件优化及酶学性质研究
收稿日期:2009-04-25
基金项目:西北民族大学研究生科研创新项目
作者简介:孟庆辉(1982-),男,河南南阳人,硕士研究生,研究方向为特有动植物生态及其分子生物学基础。
黄孢原毛平革菌低温产酶条件优化及酶学性质研究
孟庆辉1
,崔艳红
2
(1.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;河南科技学院动物科学学院,2.河南新乡453003)
摘 要:以酶活力为评价指标,对白腐真菌产酶条件进行优化,并对其部分酶作用特性进行了研究。结果表明:该菌10 条件下产L i P 、M nP 和L ac 的最佳碳源是葡萄糖;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间为72h~108h 。L i P 、M nP 和L ac 的最适反应p H 值范围均为4.4~4.8,最适底物浓度为0.8mmo l/L ~1.2mmo l/L;金属离子Cu 2+
、Ca 2+
对L i P 、M nP 和Lac 有激活作用,Fe 2+
对3种酶活有一定的抑制作用;而N a +
则完全抑制L i P 的活性,Zn 2+
、M g 2+
对3种酶活影响不大。关 键 词:白腐真菌;木质素酶;锰过氧化物酶;漆酶;统计分析
中图分类号:TQ925 文献标识码:A 文章编号:0254 5071(2009)09 0075 04
Opti m ization of low te m perat ure e nzy m es production by Phanerochaete
Chrysospri u m and t he enzym e properties
MENG Q i nghui 1
,CUI Yanhong
2
(1.Colle g e of L i f e Science and E ngineering,Nort hw est Uni versity forN ationalities,L anzhou 730030,China ;
2.C olle ge of An i m a l Science ,H e nan In stitute of Science and T echnology,X inxiang 453003,China )
Ab stract :T aki ng enzy m e acti v it y as t he assess ment i ndex ,the conditons o f enzy m e producti on by Phanerochaete Chry sosp ri u m w ere st udied i n t h i s paper .The resu ltsw ere as foll ows :at 10 ,the optm i a l carbon source for L i P,M nP and Lac produci ng w as glucose ;t he optm i a l n itrogen source w as beef extrac;t t he optm i a l i ncubati on tm i e w as 72h~108h ;t he optm i a l p H range for L i P ,M nP and L ac produci ng w ere all4.4~4.8;t he op
tm i a l s ubstrate concentra tion w as 0.8mm ol/L~1.2mm ol/L ;m etallic i on Cu 2+and Ca 2+
coul d acti vate the enzy m e produc i ng ,wh ile m etallic i on Fe 2+w ou l d i nhibit that partl y andm eta lli c i on N a +would i nh i bit L i P producing comp l ete l y ;me t a lli c i on Zn 2+,M g 2+had i nsi gnifi cant effec t on t he enzy m e ac tivity of t he three .K ey word s :Phanerochaete c hry so s p riu m;li gni nase ;manganese perox i dase ;L accase ;statisti ca l ana l ysis
酵解木质素的微生物种类很多,包括细菌、真菌和放线菌等,在木质素降解真菌中,黄孢原毛平革菌降解纤维素的能力最强,能够分泌胞外氧化酶降解木质素和半纤维素,被认为是最主要的纤维素降解微生物。黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysos pri um )在分类学
[1]
上属于担子菌
纲(basi dio m ycetes ),腐生于树木或木材上,侵入木质细胞腔,释放降解酶,导致木质素腐烂成白色海绵状团块。黄孢原毛平革菌降解木质纤维素主要依靠其产生的木质素过氧化物酶(Ligni n p eroxidase ,简称L i P )、锰过氧化物酶(M anganese Pero x i dase ,简称M nP )、漆酶(Laccase ,简称Lac)氧化各类芳香族化合物及一些难降解的物质,1984年,KU WAHARA M 等[2]首先在Phanerochaete chr y s os pori um 的木质素裂解培养液中分离检测到,随后这方面的工作逐渐展开。到目前为止,所报道的M nP 产生菌都集中在黄孢原毛平革菌中,包括Agaricu sbis p orus 、Bjerkandera adusta 等。由于其底物的多样性及酶本身结构的复杂性,所以国内的低温产酶研究尚处于初期阶段。国外的研究虽然取得一定进展,但对于低温酵解产生的L i P 、M nP 和Lac 等酶的生物学特性、高效表达体系的构建等研究尚有待深入。因此,深入探讨、研究黄孢原毛平革菌的低温产酶条件优化、酶学性质等,对指导黄孢原毛平革菌技术的工程化应用有较大价值。1材料和方法1.1菌种和培养条件
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysos p rium )5.776:购自微生物菌种保藏中心。
综合P DA 培养基(用于黄孢原毛平革菌扩大培养和菌种分离纯化)
[3]
:马铃薯提取液1000mL /L ,KH 2P O 4
1.8g /L ,葡萄糖25.0g /L ,琼脂14.0g /L ,维生素B 16 g /mL ,M gSO 4 7H 2O
2.5g /L ,p H 6.0。
基础液体产酶培养基:葡萄糖15.0g /L ,K 2H P O 4
3.6g /L ,维生素B 150g /L ,M andels '无机营养液1L 。
M andels '无机营养液
[4]
:(常量元素液:KH 2PO 43.5g /
L ,(NH 4)2SO 42.4g /L ,M gSO 40.3g /L ,Ca C l 20.6g ,加蒸馏水600mL 使之溶解。微量元素液:FeSO 45.0mg /L ,M nSO 41.6mg /L ,ZnSO 42.4mg /L ,CuSO 40.5m g /L ,加蒸馏水200
mL 使之溶解。)常量元素液与微量元素液混合后,蒸馏水定容至1000mL ,用HC l 调p H 值为5.5。1.2方法
1.2.1酶液的制备
[5]
PDA 培养基培养5d 的菌丝体加入到无菌水当中,玻璃珠打碎后,进行孢子计数,然后按照不同的量接入到250mL 三角瓶中,三角瓶装液量100mL ,接种量(以孢子计)1.0!106
个mL(培养温度28 ,转速3000r /m in 培养5d)。取30mL 基础液体产酶培养基于150mL 三角瓶中,121 灭菌30m in ,冷却接5.776原种,每瓶接种1.0!106
个/mL ,做3个重复,10 培养7d 。离心机3000r/m i n 离心
10m in ,上清液即为酶液。1.2.2酶活力测定
[6]
L ip 酶活测定:1mL 反应液加0.2mL 藜芦醇溶液(10mm ol/L )、0.4mL 酒石酸缓冲(250mmol /L,p H 3.0)、0.4mL 培养液或稀释液、20 L H 2O 2溶液(20mmo l/L ),于10 测定波长310nm 处的吸光度值变化。以每分钟氧化藜芦醇形成1 mol 藜芦醛定义为一个酶活力单位(U ),藜芦醛的摩尔吸光系数为 310=9300mo l/c m 。
M nP 酶活测定:1mL 反应液加25mm ol /L 乳酸锂,0.01%苯酚红,0.1%白蛋白,100 m ol /L M nSO 4,50mm ol/L 酒石酸缓冲液(p H 4.5)、0.1mmol /L H 2O 2,10 反应5m i n ,用1mo l/L N a OH 滴定以中止反应。以不加H 2O 2的反应液作空白,测定在波长610n m 处的吸光度值。定义吸光度值每升高0.01为1个酶活力单位。
Lac 酶活测定:3mL 反应液加2mL 溶有0.5mmo l ABTS 的0.1mm ol/L 醋酸缓冲液(p H =5.0),10 测定波长420n m 处的吸光度值变化。定义每毫升酶液每分钟氧化底物(ABTS)引起吸光度值的增加量为一个酶活单位(U )。2结果
2.1优化产酶条件的建立2.1.1
不同碳源对产酶的影响
图1不同碳源黄孢原毛平革菌产酶的情况
F igure 1 Effec t of carbon sources on enzyme producti o n by
Pha ne rochae te C h rys os p ri um
分别以葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、麸皮为基础液体发酵产酶培养基中唯一碳源,分别接种菌株[7]
于10
静置培养5d ,进行酶活力的测定,结果见图1。
试验结果(表1)经SPSS 分析可知,在p =0.05时,葡萄糖与麦芽糖、甘露糖、蔗糖、麸皮之间差异极显著,麸皮与麦芽糖、甘露糖、蔗糖差异极显著,甘露糖、麦芽糖、蔗糖之间差异不显著,葡萄糖与麸皮在此水平下都是黄孢原毛平革菌低温产L i P 、M nP 和Lac 酶最适培养基碳源;而在p =0.01时,葡萄糖与麸皮之间差异极显著。因此,葡萄糖才是黄孢原毛平革菌10 产L i P 、M nP 和L ac 酶最佳培养基碳源。
表1不同碳源之间的交互作用
Tabl e 1 I nter acti o n a mong t he carbon sources
不同碳源/(U mL -1)x x -157 x -163 x -164 x -213葡萄糖23376 70 69 20
(P=0.05)
麸皮21356 50
49
甘露糖16471
麦芽糖1636
蔗 糖
157
2.1.2不同氮源对产酶的影响
以葡萄糖为碳源,分别以牛肉膏、草酸铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素作为基础液体产酶培养基中唯一氮源,分别接种菌株于该培养基中
[7]
,于10 静置培养5d ,进行
酶活力测定。由图2可见该菌分泌L i P 、M nP 和Lac 酶活从高到低顺序依次为牛肉膏、草酸铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素。
图2不同氮源黄孢原毛平革菌产酶的情况
F i g ure 2 Effec t of nitr ogen sources on enzyme produc tion by
P ha ne rochae te C h rys os p ri um
结果(表2)分析显示,在p =0.05时,牛肉膏、草酸铵
与硝酸铵、尿素、硫酸铵的差异极显著;在p =0.01时,牛肉膏和草酸铵之间差异极显著。所以,牛肉膏是黄孢原毛平革菌10 产L i P 、M nP 和Lac 酶最适培养基氮源。
表2不同氮源之间的交互作用
Tab l e 2 I nt eracti o n among t he n itrogen sources
U /mL
不同碳源 x x -180 x -208 x -241
x -272牛肉膏400220*
*
192*
*
159
*
*
128*
*
草酸铵27292*
*(P=0.05)
6431
硝酸铵2416133
硫酸铵20828
尿 素
180
2.1.3培养时间对产酶的影响
以葡萄糖为碳源、牛肉膏为氮源,10 在基础液体产
酶培养基中培养,至24h 开始取样,以后每12h 取样测定1次,菌株5.776在72h~96h 达到产L i P 的高峰,这与培养基中限量氮源耗尽有关
[8]
,L i P 酶活在84h 酶活力高达
468U /mL ;在120h~156h 酶活力下降迅速,但在156h~168h 时又出现酶活的急剧上升,是否会出现新的产酶高峰,有待进一步研究
[9]
。漆酶从72h 酶活开始提高,96h
出现产酶高峰,酶活力达到196U /mL ,且从第5d~8d 酶活均维持在较高水平上,而且在整个生长周期内酶活的变化不大。结果得出,黄孢原毛平革菌在10 最佳培养时间是72h~108h
。
图3不同培养时间(A)、pH 值(B)、底物浓度(C )、金属离子(D )对黄孢原毛平革菌产酶的情况
F i g ure 3 Eff ect of incubation tm i e(A),p H(B),su bstrat e concentration(C)and metallic i o n(D )on enzyme production by Phane rochae te C h r ys osp ri um
2.2酶作用特性研究2.2.1酶作用最适p H 值
分别于p H 值为 3.5、4.0、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液
[10]
中进行酶解反应(图
4)表明,L i P 的最佳p H 值为4.6,M nP 的最适反应pH 值为4.8,图形呈现倒钟型,达到最适p H 值后酶活急剧下降呈正态分布。漆酶从p H 4.0~5.0都表现出较高活力,在p H 值4.8达到最高活力,4.8为其最适反应p H 。Lac 在p H 4.0~4.8时酶活力表现很强的稳定性,该Lac
为适酸酶。和秦小琼报道的红栓菌Lac 最适p H 4.0相近,但和秦小琼报道
[11]
的彩绒革盖菌Lac 最适p H 4.6略
有区别,秦小琼等曾作了不同来源Lac 的最适酶解pH 值方面的研究,不同来源的Lac 其最适p H 值确有差别,这说明不同来源Lac 虽能作用于同一底物,但酶的组成、结构可能有所差异。2.2.2酶作用最适底物浓度
设置底物浓度分别为0.05mm ol/L 、0.2mm ol/L 、0.4mmo l/L 、0.6mm ol /L 、0.8mmo l/L 、1.0mmol /L 、1.2mm ol/
L,结果(分析方法同上)显示,在10 时底物浓度在0.05mm ol/L~0.6mmo l/L酶活变化不大,底物浓度在0.8mmol/L~1.2mmo l/L酶活急剧提高。
2.2.3金属离子对酶作用特性影响
在酶液分别加入1mmo l/L的N a+、F e2+、Zn2+、M g2+、Cu2+、Ca2+1mL,结果(图6)表明,Cu2+,Ca2+对L i P、M nP 和L ac酶活有激活作用,但Cu2+在p H4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中对Lac没有激活作用,反而有一定的抑制作用,这和大多数报道[12]有所不同;Fe2+对L i P、M nP和Lac酶活有一定的抑制作用;而N a+则完全抑制L i P的活性,Zn2+、M g2+对L i P、M nP和Lac影响不大。
3讨论
通过优化产酶条件,确定了黄孢原毛平革菌10 最适培养条件和培养方法,L i P、M nP和Lac酶的产量均有较大的提高,分别均达到了优化前的6~8倍。
在培养时间对产酶的影响中,L i P在84h酶活力高达468U/mL;在120h~144h酶活力下降迅速,但在156h~ 168h时又出现酶活的急剧上升,其原因可能是:培养时间过短,随后又出现新的产酶高峰,据莫佳琳等[13]报道培养时间为7d时,4d会出现一个产酶高峰;培养时间为1月时,15d会出现新的产酶高峰相一致。
酶作用最适底物浓度中底物浓度为0.05mm ol/L~
0.6mmol/L时酶活变化不大,底物浓度0.8mm ol/L~
1.2mmol/L时酶活急剧提高。本实验没有测出10 时最佳底物浓度,今后有待进一步研究。一般认为L ac为含铜的酶[14],Cu2+对Lac有较明显的激活作用,但作者多次试验证明,Cu2+在p H4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中对L ac没有激活作用,具体原因尚有待于进一步探明。参考文献:
[1]王佳玲,余惠生,付时雨,等.白腐菌漆酶的研究进展[J].微生物报,
1998,25(4):233 235
[2]SATO S,HONDA Y,KUWAHARA M,et a.l M i crob i a l scissi on of s u lfi de
li nkages i n vu lcan i zed nat u ral rubb er by a w h i te rot b as i d i o m ycet e,Ceri poriopsis subv e rm is p ora[J].B i omacromo l ecules,2004,5(2):511 515.
[3]丁少军.云芝漆酶的培养和分离纯化的研究[J].纤维素科学与技
术,1998,6(3):16 20
[4]周金燕.真菌产生的过氧化物酶和漆酶的研究[J].微生物学报,
1993,33(5):387 391
[5]W I NGATE K G,STUTHRIDGE T,MANSFIELD S D.C ol ou r re m ed i a
ti on of pu lp m ill effl uen t us i ng purified fungal cellob i os e d ehydrogen ase: Reaction op ti m is ati on and m echan is m of degradation[J].Biotechno l Bioeng,2005,90(1):95 106.
[6]YOUNGL.L i gn i ase catal yzed deco l ori zation synthetic dyes[M].W at er
Res,1997,31:1187 1193
[7]邵 强,郭伟云,姚朝阳,等.碳源氮源对白腐真菌漆酶合成的影响
[J].河南师范大学学报,2005,5(2):94 96
[8]李宗义,刘国生,李学梅,等.微生物学实验技术[M].郑州:气象出
版社,1997:654 656
[9]杨晓宽,杜连祥,路福平.白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化[J].
生物技术,2004,14(14):35 42
[10]段新源,卢雪梅,王 蔚,等.黄孢原毛平革菌合成漆酶能力的研究
[J].山东大学学报,2002,3(1):91 94
[11]张丽萍,董 超,王迎春,等.几种离子对纤维素酶活力的影响[J].
河北省科学院学报,2000,17(4):235 238
[12]王宜磊,朱 陶.漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究[J].生态学
杂志,2002,21(2):27 29
[13]莫佳琳,文湘华,钱 易,等.白腐菌培养条件对其分泌木质素降解
酶的影响[J].中国环境科学,2005,25(5):572 575
[14]康从宝,刘 巧,李清心,等.白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
[J].中国生物化学与分子生物学报,2002,18(5):638 642
白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素
饲料研究FEED RESEARCH NO .5,2011 15 综述 白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素 张爱武1 董 斌2 康 伟11.吉林农业大学中药材学院2.沈阳鑫育隆饲料有限公司 收稿日期：2010 - 12 - 21 基金项目：吉林省长春市科技计划项目（09YJ21）通信作者：张爱武 农作物秸秆是世界上数量最多的农业生产副产品之一。据联合国环境规划署报道，世界上种植的农作物每年可提供各类秸秆约20亿t。我国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一，主要的秸秆约20种，而且数量巨大。目前秸秆的利用仍以原始利用为主，且利用方式单一，其中玉米秸秆分布广且数量多，利用潜力最大。由于目前用作饲料的数量还不到秸秆总量的10 ％，秸秆还田和副业加工利用等不到5 ％，大部分被浪费掉。麦秸和稻草等用作饲料的就更少。农作物秸秆由于营养品质低下，适口性差等原因，在饲料方面的利用率很低。饲喂反刍动物时，需对秸秆进行预处理，以提高其营养价值和适口性。基于我国国情，虽然物理和化学处理方法对秸秆品质均有较大改善，但是由于实际生产中成本、操作和环境污染等方面原因，推广使用范围较小。一系列的实验室研究和饲养试验表明：利用微生物降解方法处理秸秆具有广阔的前景。 利用微生物可转化秸秆，因为微生物能利用和分解多种畜禽不能利用的复杂有机化合物，合成含有丰富蛋白质和脂肪的菌体细胞，这些分解产物和菌体可用于饲料。微生物在秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短和可再生等优点，越来越受到国内外研究者重视。国内研究使用较多的是以乳酸菌-纤维分解菌-丙酸菌为主的微生物活菌制剂。自70年代以来，国外许多学者和研究人员致力于白腐真菌的研究。白腐真菌是一类丝状真菌，因腐生在树木或木材上，引起木质白色腐烂而得此名。它依靠降解木质纤维材料的能力穿入木质，侵入木 质细胞腔内，释放降解木质素和其他木质组分的酶，导致木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐。分类学上，白腐真菌属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。白腐真菌分布十分广泛，无论高山或平原，凡是有树木生长、存放或使用木材的地方都有分布。各地区白腐真菌种类的变化常随树木种类与气候诸多条件而改变。 1 白腐真菌降解秸秆的效果 早在20世纪70年代，国外就比较重视对白腐真菌的研究。我国近来利用白腐真菌降解秸秆的研究已有所进展。白腐真菌通过次生代谢物包括，各种胞外酶、过氧化物酶、二价锰过氧化物酶及漆酶的催化作用有效降解木质素。王连稹报道，白腐菌处理秸秆主要是由于其在生长活动过程中能分泌多种酶，这些降解酶主要是木质素降解酶，其次是纤维素降解酶及半纤维素降解酶，以降解细胞壁物质中的木质素、纤维素及半纤维素。已知的白腐真菌包括，栓菌属、平革菌属、侧耳菌属、半胶菌属和黑管菌属等；常见的包括，长绒毛栓菌、云芝、黄孢原毛平革菌、糙皮侧耳菌、紫半胶菌、黑管菌和裂褶菌等，国际上很多研究者发现，有降解能力的是黄孢原毛平革菌，属非褶菌目、伏革科和显革菌属。Zadrazil 等(1984) 对包括桦多孔菌、漏斗状侧耳、云芝深褐色次革菌、辐射卧孔菌、粉状侧孢霉和拟革盖菌等200个品系进行筛选后发现，有几十种白腐真菌能显著改善秸秆的适口性，提高木质素的降解率，大幅度提高秸秆的瘤胃干物质消化率，从而使秸秆成为反刍动物的一种含较高营养价值的廉价能量饲料。 有关香菇菌的研究报道，香菇和平菇等木腐类真菌分解木质素和纤维素的能力较强，这类食用菌
酶学性质研究
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
耐高温_淀粉酶的酶学性质研究
３结 论 植物乳杆菌素Ｌ－１经硫酸铵沉淀，透析除盐后效价达１２８０ＡＵ／ｍｌ，作用方式为杀菌。在７、１５、３０、３７℃下，添加植物乳杆菌素Ｌ－１对单增李斯特菌都有一定的抑制作用。７℃下该细菌素在１４４ｈ内控制住初始菌数，温度较高的情况下则可以在短时间内迅速降低活菌数。在选用的六种ｐＨ下，ｐＨ７．０时植物乳杆菌素Ｌ－１的抑菌效果最好。不论在培养基中还是ｐＨ７．０，５ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中，盐对该细菌素具有一定的拮抗作用，各盐分之间和同种盐不同浓度之间差异不显著。有关吸附作用的研究发现：低ｐＨ（５．０～５．５）下，植物乳杆菌素Ｌ－１不能吸附在单核细胞增生李斯特氏菌上，而ｐＨ６．０～７．５下有５０％吸附在指示菌上。盐对该细菌素吸附单核细胞增生李斯特氏菌没有显著影响。 参考文献： ［１］ 吕燕妮， 李平兰， 江志杰． 乳酸菌３１－１菌株产细菌素的初步研究［Ｊ］． 中国食品学报， ２００３， 增刊： １３０－１３３． ［２］郁庆福， 蔡宏道， 何晓青， 等． 现代卫生微生物学［Ｍ］． 北京： 人民卫生出版社， １９９５． １１６－１１７． ［３］ Ｓｏｐｈｉｅ Ｍ Ｐ， Ｅｍｉｌｉａ Ｆ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｎ ＥＦＳ２， ａｎ ａｎｔｉｌｉｓｔｅｒｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｈｅｅｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， ３０： ２５５－２７０． ［４］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． ＣａｎａｄａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ３９： １１７３－１１７９． ［５］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ Ｃ１９， ａｎ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒａ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏ－ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１， ６８： ９３－１０４． ［６］ Ｒｏｎｇｇｕａｎｇ Ｙ， Ｍｏｎｔｙ Ｃ Ｊ， Ｂｉｂｅｋ Ｒ． Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２， ５８： ３３５５－３３５９． ［７］还连栋， 贾士芳， 庄增辉， 等． 乳链菌肽（ＮＩＳＩＮ）的杀菌作用机制［Ｊ］．中国食品添加剂， １９９７， （４）： ２０－２３． ［８］ Ｓ Ｔｏｄｏｒｏｖ， Ｂ Ｏｎｎｏ， Ｏ Ｓｏｒｏｋｉｎｅ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍＳＴ ３１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ４８： １６７－１７７． 收稿日期：２００５－０１－２１ 作者简介：毕金峰（１９７０－），男，副教授，博士后，主要从事食品化学与生物技术研究。 耐高温α－淀粉酶的酶学性质研究 毕金峰１，董福奎２ （１．中国农业科学院农产品加工研究所 农业部农业核技术与农产品加工重点实验室，北京 １０００９４； ２．内蒙古呼和浩特市赛罕区蔬菜技术推广站，内蒙古 呼和浩特 ０１００２０） 摘 要：耐高温α－淀粉酶是淀粉生产麦芽糖的关键酶。本文对两种耐高温α－淀粉酶的酶学性质进行了对比研究。结果表明：两种酶的耐高温能力差别较大，酶活差别明显；最适ｐＨ值均为７．０，耐酸性较差；当Ｃａ２＋浓度在７～９ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活提高明显。关键词：耐高温α－淀粉酶；性质 Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ＢＩ Ｊｉｎ－ｆｅｎｇ１，ＤＯＮＧ Ｆｕ－ｋｕｉ２ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ＭＯＡ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４， Ｃｈｉｎａ；２．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｏｐｕｌａｒｉｚｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｉｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｉｎ Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ Ｃｉｔｙ， Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ ０１００２０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍａｌｔｏｓｅ． Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇα－ａｍｙｌａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｔｈｅ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｅｖｉｄｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｗａｓ ７．０， ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｐｏｏｒ． Ｔｈｅ
实验 酶学性质研究
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
白腐菌液体菌种培养条件的试验研究_吴薇
Ｎｏ．１．２００８ 收稿日期：２００７－０７－２０＊通讯作者 基金项目：中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项。 作者简介：吴薇（１９７０—），女，浙江人，博士研究生，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏工程和生物质材料工程。 吴 薇１，顿宝庆２，姜训鹏１，吕程序１，高振江１＊，路明２＊ （１．中国农业大学工学院，北京１０００８３；２．中国农科院生物质能源研究中心，北京１０００８１） 摘要：对３种白腐菌的液体菌种培养条件进行了优化研究。结果表明，黄孢原毛平革菌液体菌种培养的较优条件为培养时间４ｄ、初始ｐＨ６．０、装量５０ｍＬ、琼脂添加量０．２％，Ｗ３液体菌种培养的较优条件为培养时间５ｄ、初始ｐＨ６．５、装量５０ｍＬ、琼脂添加量０．３％，变色栓菌液体菌种培养的较优条件为培养时间５ｄ、初始ｐＨ６．５、装量７５ｍＬ、琼脂添加量０．１％。关键词：白腐菌；液体菌种；培养条件中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５－９９８９（２００８）０１－００１６－０３ 白腐菌液体菌种培养条件的 试验研究 Ｓｔｕｄｙｏｎｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉ ＷＵＷｅｉ１，ＤＵＮＢａｏ－ｑｉｎｇ２，ＪＩＡＮＧＸｕｎ－ｐｅｎｇ１，ＬＶＣｈｅｎｇ－ｘｕ１，ＧＡＯＺｈｅｎ－ｊｉａｎｇ１＊，ＬＵＭｉｎｇ２＊ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆ ＥｎｅｒｇｙＳｏｕｒｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ， ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｔｕｄｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉｉｎｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｆｉｅｌｄｓｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｉｎａｌａｒｇｅｅｘｔａｎｔ． ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｗａｓ４ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｐＨ６．０，ｌｉｑｕｉｄｃａｐａｃｉｔｙ５０ｍＬ，ａｇａｒｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ０．２％．Ｔｈｅ 提高海藻糖的百分含量。 将海藻糖和三氯乙酸混合液用３倍体积的９５％乙醇在４℃冰箱中醇析１２ｈ后，在５０００ｒ／ｍｉｎ下离心２０ｍｉｎ得到沉淀物。将此沉淀物冷冻干燥１２ｈ后，可得海藻糖晶体。 参考文献： ［１］ＥｌｂｅｉｎＡＤ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆα，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ［Ｊ］．ＡｄｖＣａｒｂｏ－ｈｙｄＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ，１９７４，３０：２２７－２５６ ［２］戴秀玉，程苹．海藻糖的生理功能、分子生物学研究及应用前景［Ｊ］．微生物学通报，１９９５，２２（２）：１０２ ［３］程池．天然生物保存物质———海藻糖的特性和应用［Ｊ］．食品与发酵工业，１９９６，２２（１）：５９－６４ ［４］ 刘洋，张红缨，张今．酵母菌中海藻糖的提取方法与糖代谢研究［Ｊ］．吉林大学自然科学学报，１９９８，（４）：８５－８８ ［５］章银良，毛多斌，张勋．产海藻糖酿酒酵母培养基优化及生理学研究．生物技术，２００１，１１（６）：２７－２９ ［６］ 章银良，熊卫东，张露，等．胁迫条件下酿酒酵母积累海藻糖的发酵研究［Ｊ］．郑州轻工学院学报（自然科学版），２００３， １８（２）：５０－５２［７］ＪｏｈａｎＭＴ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖｉｅｗ［Ｊ］．１９８４，４８（１）：４２－５９［８］ ＪｏａｏＡＪ，ＭａｒｉａＤＬ，ＰｏｌｉｚｅｌｉＴＭｅｔａｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ－ｇｙＬｅｔｔｅｒ，１９９７，１５４：１６５－１７１ ［９］ＣａｒｍｅｎＬＡＰ，ＡｎｉｔａＤＰ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ， １９９６，（２）：２９３－３１４ ［１０］ＫｏｋｉＳ，ＴｏｓｈｉｙａＫ，ＥｉｉｃｈｉＴｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ－ ｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（１１）：４３４０－４３４５ ［１１］ＳＪＳｔａｓｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，ＲＪＳｅｖｉｏｕｒ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｏｌｙｓａｃ－ ｃｈａｒｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＦｕｎｇｕｓＡｃｒｅｍｏｎｉｕｎｐｅｒｓｉｃｉｕｍｗｉｔｈｆａｔｔｙａｃｉｄｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈａｎｄＢｉｏｅｎｇｉ，１９９０，３６：７７８－７８２ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 食品开发与机械 １６
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究解析
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究（东北农业大学，生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150030） 摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中显蓝色性质，探究酶活性影响因素，常见的影响因素有：温度 pH 活性剂和抑制剂等。 Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time. 关键词： 淀粉酶活性温度 PH 激活剂和抑制剂 引言： 新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化与能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。酶是细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般催化剂比较有以下不同点：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度专一性、酶活性受到调节和控制。而调节和控制又包括调节酶浓度、抑制剂和激活剂的调节等。[1] 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶活性随种子萌发将升高，有利于淀粉被降解为植物生长发育所需的葡萄糖。许多微生物包括
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
实验五 酶的基本性质
实验一酶的性质研究 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，因此也叫生物催化剂。生物体内存在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能够迅速完成复杂的生物化学反应。 酶有的是单纯蛋白质，有的是结合蛋白质。因此，凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性，结合蛋白质的非蛋白部分叫做辅酶或辅基。习惯上，将与蛋白质结合的紧而不易分离的非蛋白部分称为辅基，辅基不能通过透析的方法从酶分子中除去；而将与蛋白质结合的不紧而易分离的非蛋白质部分称为辅酶，辅酶可以通过透析的方法从酶分子中除去。目前许多酶已经能够制成结晶。 酶具有高度的专一性（特异性）。温度和pH对酶的活性有显著的影响。能使酶的活性增加的作用称为酶的激活作用，使酶的活性增加的一些物质称为酶激活剂；能使酶的活性减弱的作用称为酶的抑制作用，使酶的活性减弱的一些物质称为酶的抑制剂。激活剂与抑制剂常表现某种程度的特异性。， 物质代谢是生命现象的基本特征。在机体中了解温度对没活性的影不断进行着的同化作用和异化作用，绝大多数都是在酶的影响下进行的。所以，生活机能在某种程度内可以说是由机体内酶类的含量及活性决定的。食品、发酵、制药、制革、造纸、纺织等工业部门以及临床检验等都和酶有密切关系。因此，酶的研究在生物化学理论上及生产实践上都占有极其重要的位置。 温度对酶活性的影响 一目的和要求 通过检验不同温度下唾液淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响。进一步明确最适温度的概念。 二原理 酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10℃，反应速度就加快一倍左右，通常用温度系数表示，一般情况下的温度系数约等于2，最后反应速度达到最大值。另一方面，酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶的最适温度。高于或低于最适温度时，反映速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37℃-40℃，植物酶的最适温度为50℃-60℃。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用时间的长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，，在酶反应的最适温度下进行，测定酶促反应的初速度。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。 酶对温度的稳定性与其存在的形式有关。大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定能在室温下保持数月以至一年，在低温下保存的时间更长，因此，酶制剂一般以冻干粉状在低温下冷冻保存。溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，且易为微生物所污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，溶液状态的酶，在保存时都要加入等体积的甘油，并贮存在4℃冰箱中，酶活性可保持两周至几个月。酶在高温下就更不稳定了。 酶的活性通常是用测定酶作用基质在酶作用前后的变化来进行观察的。
黄孢原毛平革菌培养实验要点
黄孢原毛平革菌的培养实验 关键词：显微镜三角瓶 ATCC 北京标准物质网 一、黄孢原毛平革菌 试验所用菌种黄孢原毛平革菌BKM-F-1767，密封，置于冰箱中。 二、黄孢原毛平革菌的培养基 1．黄孢原毛平革菌培养基的组成 基本培养基：2.Og 马铃薯浸出液，20g 葡萄糖，3g KH 2PO 4 ，1．5g MgSO 4 ·7H 2 O， 0.1mg FeSO 4·7H 2 O，0.2mg CuSO 4 ·5H 2 O，8mg 维生素B1，用蒸馏水定容到1000mL。 斜面孢子培养基：采用改良PDA培养基(L-1)：200g 马铃薯浸出液，20g 葡 萄糖，20g 琼脂，3g KH 2PO 4 ，1.5g MgSO 4 ·7H 2 O，0.1mgFeSO 4 ·7H 2 O，0.2mg CuSO 4·5H 2 O，8mg 维生素B1。 2．培养基的消毒灭菌 为了对微生物进行纯培养，防止杂菌污染，必须对微生物生长的培养基进行消毒灭菌。培养基的消毒灭菌步骤如下：将装有液体培养液的锥形瓶塞上棉塞，罩上牛皮纸，用线扎紧。首先在高压灭菌锅内放水，使水面超过加热电阻丝两指左右，放置好锅内桶，在锅内放入待灭菌的培养基和需消毒的物品，盖好锅盖，拧紧螺钉，打开放气阀。然后接上电源，待水烧开3min后(将锅内冷空气赶出后)，关闭放气阀，待压力升高。当温度指到121℃，压力为0．1 5MPa时，使温度压力恒定。从这时计时25min，关掉电源，等锅内温度冷却下降至0℃刻度，打开放汽阀放气，打开锅盖．再取出培养基及消毒物品。至此，消毒灭菌完毕。 所谓“白腐真菌”，并非生物学上的概念。 第一，它不属于生物系统分类学范畴的术语，而是从功能角度上对生物进行描述和界定。 第二，它既不专指某一种真菌，也不泛指某一些真菌，而是限定为一类腐生在木质上有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化——白腐的丝状真菌的总称。
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质 XXX A091100XX 生学1101 Enzymatic properties of amylases from germinant wheat 摘要：在小麦种子中提取淀粉酶，研究相关酶学性质，了解温度、PH值以及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响，并且对酶的活力进行测定。不同的温度、PH条件下和加激活剂或抑制剂情况下淀粉酶将淀粉水解的程度不同，产物遇碘呈现不同的颜色，由此可知道酶活性的最适温度和最适PH，也可知道激活剂能使酶的性增加，抑制剂能使酶的活性降低。对酶的活力进行测定时，是测定产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力[1]。 关键词：淀粉酶、温度、PH值、激活剂、抑制剂、分光度计 研究背景：二十一世纪是生物信息时代，各种生物学领域研究层出不穷 ,对酶的研究是其中一个重要方面,目前对酶的研究已转入了后期，各种酶的生化性质也相继被研究出，酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子[2]。通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。 原理：淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本
白腐真菌在环境保护中研究与应用进展
摘要综述了近年来白腐真菌在环境保护中的研究进展，主要包括在多种工业废水处理、垃圾堆肥及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的应用。关键词 白腐真菌 环境保护 应用 中图分类号 Ｘ７０３．１ＴＱ０８５＋．４１３ 白腐真菌在环境保护中研究与应用进展 吴林林 阮宇鹰 武琳慧黄民生 华东师范大学环境科学系（上海 ２０００６２） 环境保护 ０前言 环境中难降解有机污染物日积月累并持久存在 的结果已严重危害生态系统的健康和人类社会的可持续发展。这些污染物产生于各种工农业生产及人类生活活动中，除难以降解外它们还具有较高的生物毒性和致癌、致畸、致突变危害性，是环境治理与保护工作的重点和难点。白腐真菌通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等关键酶催化自由基链式反应，对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。自２０世纪８０年代以来，国内外许多学者开始应用白腐真菌进行环境治理与修复的实验和应用研究。本文对白腐真菌在多种工业废水处理、垃圾及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的研究与应用进展进行了综述。 １ 白腐真菌在工业废水处理中的研究与应用 １．１ 造纸废水处理 吴涓等研究了不同白腐真菌对灰法造纸黑液废 水的处理效果，考察了黑液废水浓度和碳氮源添加量对黑液脱色及ＣＯＤＣｒ去除率的影响。研究结果表明，变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｃｏｌｏｒ）对黑液废水的 ＣＯＤＣｒ和色度的去除率分别达到６４．２５％和４７．３１％， 在添加０．２％纤维二糖和０．０２％天冬酰胺的情况下应用自行分离、筛选的白腐真菌（ＡＨ２８－２）处理黑液废水时ＣＯＤＣｒ去除率也达到了６０％以上。该研究还发现，锰过氧化物酶（ＭｎＰ）和木质素过氧化物酶（ＬｉＰ）酶活相对比值对造纸黑液的ＣＯＤＣｒ去除率有明显影响，ＭｎＰ／ＬｉＰ酶活比值越高时ＣＯＤＣｒ去除率也越高，说明在该降解系统中ＭｎＰ起到主要作用［１］。 Ｍａｒｗａｈａ等分别采用黄麻绳、棉花和小麦作为黄孢 原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ，简称ＰＣ菌，下同）生长、挂膜载体在厌氧条件下对造纸黑液进行预处理，结果表明，以黄麻绳为载体时废水的脱色率和ＣＯＤＣｒ去除率最高，相应的运行参数为温度４０℃、ｐＨ５．５、 菌丝体负荷３４０ｍｇ、外加葡萄糖浓度１％（ｍ／ｖ）、 停留时间７２ｈ。Ｊｏｙｃｅ等应用ＰＣ菌构建新型生物转盘（ＭｙＣｏＲ反应器，即真菌生物转盘反应器）来处理纸厂漂白废水。实验结果表明，这种生物转盘能够有效降低白水的ＣＯＤＣｒ和ＢＯＤ５并使氯化木质素脱氯。秦文娟等［２］将几种不同的白腐真菌菌丝悬浮液与海藻酸钠、氯化钙混合后凝固成球状，用于造纸Ｅ段氯漂废水的脱色处理，结果发现Ｐｏｌｙｓｔｉｃ－ ｔｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ和Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔｅ两种ＰＣ菌对废水的 脱色效果最好（２４ｈ内废水色度下降５０％左右）。王双飞等在８％ＰＶＡ、０．５％海藻酸钠、３％细胞浓度的条件下制备固定化ＰＣ菌间歇式处理造纸Ｅ段氯漂废水。实验结果表明，在连续运行１个月内，处理效果稳定，废水的脱色率保持５０％左右，ＴＯＣ去除率分别保持５０％～５８％，比游离态ＰＣ菌间歇式连续处理分别高出１７％和１２％。 １．２染料及印染废水处理 张朝晖等应用ＰＣ菌生物膜反应器进行酸性染 料卡布龙红和弱酸大红的降解实验。结果表明，在限碳培养条件下挂膜培养５ｄ后，木素过氧化物酶活力达到最高，此时分别加入酸性染料卡布龙红和弱酸大红，质量浓度分别为２５、５０、１００ｍｇ／Ｌ和１２．５、 ２５、５０ｍｇ／Ｌ，４８ｈ后培养液基本脱色，较高浓度下菌膜上有少量吸附的残余染料，５ｄ后染料质量降解 率分别为１００％、８８％、９２％和５８％、６５％、３８％［３］。 李慧第一作者简介：吴林林男１９８１年生华东师范大学环境科学系在读硕士主要从事水污染控制与生物修复研究 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．１Ｊａｎ．２００６ 上海化工 ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ ８??
淀粉酶酶学性质的研究
生物化学学号： 淀粉酶酶学性质的研究 学生姓名：#### 指导教师：##### 所在院系：生命科学学院 所学专业：####### 学号：##### #### 大学 中国·哈尔滨 2011 年12 月
摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。酶的活性又同时受到温度、PH、激活剂抑制剂等的影响。 关键词： 淀粉酶活力温度 PH 激活剂和抑制剂 前言： 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。 此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子和激活因子，也有部分淀粉酶为非Ca2+依赖型。淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖，其中真菌a-淀粉酶水解淀粉的终产物主要以麦芽糖为主且不含大分子极限糊精，在烘焙业和麦芽糖制造业具有广泛的应用。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50%，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70%分解限度的（最终游离出葡萄糖）。 通过研究淀粉酶的性质，能使我们更好的了解它，并充分利用于工业生产、食品加工、医疗等产业。
酶性质
酶性质————最适PH选择 1.原理： 酶的催化活性与环境PH有密切关系，通常各种酶只在一定PH范围内才有活性，酶活性最高时的PH，称为酶的最适PH。高于或低于此PH时酶的活性逐渐降低。值得指出的是，不同的酶最适PH也不同，如胃蛋白酶的最适PH为1.5—2.5，胰蛋白酶的最适PH为8。 酶的最适PH不是一个特征性的物理常数，对于同一个酶，其最适PH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。如唾液淀粉酶最适PH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适PH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲液中则为5.6。 2.试剂： 1. 0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液 , 用0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液配制PH 5.4，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的缓冲液 3.操作： 保温时间指从加入酶液开始到从水浴中取出试管加入碘液的一段时间.摸准保温时间是实验的关键步骤之一. 取一支试管,加入0.3%氯化钠0.5%淀粉溶液2毫升,加入PH6.8磷酸氢二钠—柠檬酸钠缓冲液3毫升,及稀释100—300倍的唾液2毫升.充分摇匀后,放入37度水浴中保温并记时,每隔1分钟用滴管取1滴混合液,至于点滴板上,加1滴碘液,检验淀粉水解程度,待呈橙黄色时,为进一步确定保温时间,应加1滴碘液至试管中,若为橙黄色表示反应完全,记录所需保温时间. 若2-3分钟内,取出的保温液与碘液作用呈橙黄色,则说明酶活力太高,应再稀释唾液淀粉酶,记录稀释倍数,若保温时间超过15分钟,说明酶活力太低,要提高酶的浓度.最佳保温时间8-15分钟以内,因此要掌握好唾液淀粉酶的稀释倍数,确定准确的保温时间才能进行下步实验.取7支试管按下表操作,保温时间参考以上操作: 从各管呈现的颜色,判断不同PH对淀粉水解和淀粉酶活性的影响,并确定其最适PH值.
印染
白腐真菌对染料废水脱色及降解的研究进展 环境081 刘冰星0810240122 摘要：系统介绍了白腐真菌对染料脱色和降解作用的研究进展、脱色机理及其影响因素，旨在为以后 真菌对染料废水的脱色及降解提供参考和依据． 关键词：白腐真菌；染料；脱色及降解；机理 在所有的工业废水中，来自染料工业和印染行业的染料废水是最难处理的工业废水之一，这是因为染料是一种化学结构复杂的化合物，它含有人工合成的复杂的芳香烃分子结构很难被除去．据报道，商业染料的种类约有10万种，每年染料的总产量为7×10 t，我国年产量已达1．5×10 t，这其中大约有10％～15％的染料会直接随废水排入环境当中，这种现象在我国更为严重．染料具有高度的稳定性，难被生物降解，在环境中可以存留很长时间，染料的颜色是造成染料废水高色度的原因，从而它们产生视觉污染，使水体透明度下降，并且许多染料是由一些致癌物质(例如苯胺及其他芳环物质)合成，因此染料废水必须进行处理． 染料废水通常通过物理或化学方法处理，主要包括吸附法、絮凝沉淀技术、化学氧化法、离子交换技术、超滤膜技术、光催化技术等，然而，这些技术对废水中色度的去除效果不太明显，并且处理费用高，处理废水的范围较窄，所以众多学者都把研究焦点集中在微生物对染料废水的处理上．近几年，已有大量可以降解或吸附染料的微生物的报道，这些微生物包括细菌、真菌和藻类． 自然界中白腐真菌(white rot fungi)是一种重要的生物资源，它们对木质素具有良好的降解能力．Eaton 等L5 于1980年将白腐真菌应用到对造纸废水和印染废水的处理中，此后许多研究证实了白腐真菌在废水处理中是很有发展前景的微生物．其中研究最多的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)．白腐真菌产生的细胞外酶(包括木质素过氧化物酶Lips和锰过氧化物酶Mnps)被认为是降解木质素和染料的特殊酶系L4 J．这些酶具有非特异性、无需底物诱导的特殊性能，对许多结构不同、高度稳定、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。本文综述了白腐真菌对印染工业中染料的脱色研究，讨论了其脱色机理及其影响因素，旨在为以后染料废水的生物处理提供依据． 1 白腐真菌的生物学背景、种类及培养特性 1．1 白腐真菌的生物学背景 木腐真菌寄生或腐生在木材上，能释放降解性酶降解木质素、纤维素，侵入木质细胞腔内获取营养，导致木材腐朽，成为海绵状团块．根据腐朽后团块颜色分为白腐真菌和褐腐真菌Ll ．白腐真菌多为担子菌纲(Ba—sidiomycetes)．多数的多孔菌、伞菌都属于这一类型．《中国真菌志》(多孔菌科卷)记载了46属137种，其菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合，多核的分生孢子常为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统 1．2 白腐真菌的种类’ 白腐真菌的种类很多，其中典型的有如下几种：黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，Tinc— toporia sp．，特罗格粗毛盖菌(Funalia trogii)，Trametes hirsute，采绒革盖菌(Trametes versicolor)，烟管菌 (Bjerkandera sp．)，Pleutrotus ostreatus，杂色云芝(coriolus versicolor)，朱红密孔菌(Pycnopororus cinnabar—i )等，