黄孢原毛平革菌的培养实验

黄孢原毛平革菌的培养实验

关键词：显微镜三角瓶 ATCC 北京标准物质网

一、黄孢原毛平革菌

试验所用菌种黄孢原毛平革菌BKM-F-1767，密封，置于冰箱中。

二、黄孢原毛平革菌的培养基

1．黄孢原毛平革菌培养基的组成

基本培养基：2.Og 马铃薯浸出液，20g 葡萄糖，3g KH

2PO

4

，1．5g MgSO

4

·7H

2

O，

0.1mg FeSO

4·7H

2

O，0.2mg CuSO

4

·5H

2

O，8mg 维生素B1，用蒸馏水定容到1000mL。

斜面孢子培养基：采用改良PDA培养基(L-1)：200g 马铃薯浸出液，20g 葡

萄糖，20g 琼脂，3g KH

2PO

4

，1.5g MgSO

4

·7H

2

O，0.1mgFeSO

4

·7H

2

O，0.2mg

CuSO

4·5H

2

O，8mg 维生素B1。

2．培养基的消毒灭菌

为了对微生物进行纯培养，防止杂菌污染，必须对微生物生长的培养基进行消毒灭菌。培养基的消毒灭菌步骤如下：将装有液体培养液的锥形瓶塞上棉塞，罩上牛皮纸，用线扎紧。首先在高压灭菌锅内放水，使水面超过加热电阻丝两指左右，放置好锅内桶，在锅内放入待灭菌的培养基和需消毒的物品，盖好锅盖，拧紧螺钉，打开放气阀。然后接上电源，待水烧开3min后(将锅内冷空气赶出后)，关闭放气阀，待压力升高。当温度指到121℃，压力为0．1 5MPa时，使温度压力恒定。从这时计时25min，关掉电源，等锅内温度冷却下降至0℃刻度，打开放汽阀放气，打开锅盖．再取出培养基及消毒物品。至此，消毒灭菌完毕。

所谓“白腐真菌”，并非生物学上的概念。

第一，它不属于生物系统分类学范畴的术语，而是从功能角度上对生物进行描述和界定。

第二，它既不专指某一种真菌，也不泛指某一些真菌，而是限定为一类腐生在木质上有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化——白腐的丝状真菌的总称。

白腐真菌是木腐真菌中对木质素降解能力最强的成员，是已知的能在纯培养

中将木质素彻底降解为CO

2和H

2

O的唯一的一类生物，因分解术材后留下的残留

物为白色而得名。虽然其中的某些种相对于纤维素类成分而言更偏分解木质素，但是它们在腐烂木质过程中几乎是同时破坏多糖和木质素，即能在一定条件下将

木质的主要成分(木质素、纤维素、半纤维素)全部降解为CO

2和H

2

O，因在分解

过程中木质不被着色，故仍保持白色。

黄孢原毛平革菌是白腐真菌的模式菌种，属担子菌纲，典型的木质素降解菌，一般腐生于树木或木材上，使木材上出现袋状、片状或有环痕状等形状的淡色海绵状团块。黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体。菌丝常为多核，一个细胞内随机分布可多达15个核，少有隔膜，无锁状联合。多核的分生孢子常为异核体，担孢子却是同核体。交配系统有同宗配合和异宗配合。在合适的培养条件下，菌丝生长旺盛，且喜欢在空气和水的界面上伸展，容易产生大量的无性分生孢子。分生孢子为具有疏水性且直径5～7 μm的卵形颗粒；孢子表面有小杆状结构，带负电荷，等电点接近2．5；表面组成为35％的蛋白质，20％的多糖，33％的类烃物质。分生孢子容易形成及具有数量很大的特点，为苗的种质保存、接种量化和遗传操作提供很大的便利。

在整个生活周期中，黄孢原毛平革菌的子实体阶段并不占主要地位，Gold 等研究了其子实体形成的生理条件，试验表明：通过对葡萄糖和氮代谢物的抑制，可以控制菌的子实体形成，菌的子实体形成及以后的担孢子的生成。常10～14d 内可诱导完成：碳源对子实体形成有很大的影响，其中Walseth 纤维素是最佳碳源。氮源的种类和浓度，菌的代谢等对子实体形成产生影响，细胞内环腺苷酸能扭转葡萄糖对子实体形成的抑制作用。研究获得了菌的子实体及担孢子提出了调节模式，从而为菌的杂交提供操作途径。

黄孢原毛平革菌的生长分为营养期(初生生长)和繁殖期(次生生长)两个阶段，它们大致对应于细菌系统生长的对数期和禁止期。营养期时，生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期时，生长基本停止，甚至发生生物量的下降。因碳、氮营养的限制而触发了次生代谢，进入了木质素降解阶段；两者之间可能会存在一个停滞期。在液体培养条件下，接种后0～24h孢子萌发、菌丝线性生长、营养氮消耗；24～48h线性生长中止、铵透性酶活性的抑制被解除(指示氮危机)；72～96h出现木质素降解活动(合成的14C一木质素一CO

2

)。总之，黄孢原毛平革菌的生长和代谢活动是复杂的，又是密切与木质素的降解相关的。

黄孢原毛平革菌可在木质索细胞腔内产生大量细胞外过氧化物酶，有很强的降解木质素大分子的能力，与对其他难降解的物质一样，木质素实际上是被共代谢的。共代谢有两种方式。

一种是通常描述的情况：某种生物能将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物的氧化所产生的能量去维持生长；这种现象被称为共氧化、无偿代谢或幸运代谢。

二种方式是：一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用．对某化合物进行降解。表面上黄孢原毛平革菌属于前一种情况，但因为其对木质素的降解与其本身的初生生长并非同时发生，所以黄孢原毛平革菌对木质素的生物代谢途径和类型是十分复杂多样的。

此外．黄孢原毛平革菌的生长及代谢特征，还涉及其他的营养元素的调节，受到培养方式、各种因子和参数等的影响，总之十分复杂。又因木质素是主要植物成分和煤的基本前提物，其结构都是以缩合芳香环为核心结构单元的三维空间的高分子聚合物，主要键型及化学组成都基本相似。事实证明，白腐真菌能氧化分解不少煤的组分，故本实验选用黄孢原毛平革菌来进行煤炭降解转化实验。

黄孢原毛平革菌具有特征反应，即反应。最适生长温度为28～39℃，培养温度以28℃或39℃为宜。

实验表明，采用孢子接种物可以很快且正常地启动培养反应。孢子接种后，孢子萌发成菌丝，菌丝相互交织成网，1～2d内形成伸展充满整个容器液面的白色薄膜，成为菌丝垫或菌垫。随着培养时间的延长，菌垫与空气接触的表面会形成白色粉状物——孢子。

显微镜观察，菌丝的形态与菌的生理状态相关。在培养初期(10d)，菌丝较托，有的呈现螺旋状，无侧分枝，还可以看到厚垣孢子，菌丝在约10d后形态上将经历显著的变化：从老菌丝的细胞壁中直接发育长出新菌丝分枝，菌丝的生长有限且短小，表现出不同于初期的、以菌丝顶端生长为特征的模式。菌丝的这种生长方式及形态特征，与培养体系中木质素降解活性同时发生。

在液体振荡培养过程中，孢子接种后，萌发的菌丝在一定的摇速作用下相互缠绕成团，1～3d内形成在容器里随机碰撞的白色小球，称为菌丝团或菌团，孢子接种物形成菌团被认为是一种自然发生的自固定化过程。在浸没培养中，菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种基大，菌团越大；转速越大，菌团越小，数目越多。在100～200r／min下，菌团直径为3～5mm。后来的实验研究表明，在相同的实验条件下，经过诱变后的菌在振荡培养时，菌团的直径变小，有的还会发生变色反应，其机理有待以后进一步研究。

黄孢原毛平革菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感，产生这种情况的生理基础是：菌在对木质素及其他异生物质的降解中主要起作用的“工作酶”为胞外

酶，菌又是好氧微生物，氧是影响反应及降解效率的重要因子；为提高氧的运输及传质效果所采用的振荡，会严重破坏酶的结构和活性。

黄孢原毛平革菌的固体培养主要是平板培养，研究实验是以扩大菌的生物量或大量获得孢子为目的的繁殖培养或扩增性培养。在繁殖培养的平板体系中，无论是孢子接种还是菌丝体接种，菌在平板上呈扩散状生民，数天内整个平板表面布满了白色的菌丝。菌丝向培养基内伸人，在离表面约1mm厚的琼脂区内形成坚固的菌丝层。随着培养时间的延长，菌丝向气相伸展，产生大量的孢子，形成的白色粉状物遍布全平板。如果是进行检测培养，则在接种区周缘先形成反应区带，区带的宽度随反应时间而增大；理想条件下会导致整个平板发生反应。

这种现象在以染料为处理对象的平板中最为明显，染料脱色或变色区带的宽度及反应程度，直观地指示了菌的降解能力。煤炭生物降解转化实验的平板转化实验，即是利用平板培养过程中发生的变色反应来进行的；在煤炭生物降解转化过程中采用固体形式，其意义更多的偏向于定性实验研究。总之，平板体系具有反应迅速、操作简单、测定方便等优点，在以定性为主要目的的初试性研究中具有一定意义和优势。

根据球红假单胞菌微生物生长量的测定方法，选用干重测定法对黄孢原毛平革菌进行生长量的测定。其方法为：用60℃干燥箱烘干至恒重后，用称重的滤纸来过滤培养液。由于黄孢原毛平革菌菌丝附着在锥形瓶壁上，用蒸馏水洗涤干净并过滤；用蒸馏水洗涤过滤物除去培养基成分后，转移到培养皿中，另取一干净滤纸密封培养皿，置60℃干燥箱烘干6h后，称重。

从培养过程中可以发现，24h之前黄孢原毛平革菌培养液中菌丝体很少，30h 之后菌丝体快速生长，42h之后菌体生长速度开始趋于缓和，这可能是由于培养液中营养物质消耗殆尽，并且菌体进入了生长期后期造成的。另外，还可以观察到在液体培养基中菌体的生长速度比在固体培养基中的快，且随着培养时间的延长，菌体聚集成块，最后浮于培养液的表面。分析可知，黄孢原毛平革菌的生长期在30h～42h之间。黄孢原毛平革菌培育生长曲线如图3—1所示。

1．群体形态特征

黄孢原毛平革菌的形态特征描述如下：

(1)固体培养

菌种接种后，在平板上呈扩散状生长，数天内整个平板表面布满了，白色的菌丝。菌丝向培养基内伸人，在离表层约1mm厚的琼脂区内形成坚固的菌丝层。随着培养时间的延长，菌丝向气相伸展，产生大量的孢子，形成的白色丝状物遍布全平板，如图3—2所示。

(2)液体培养

①静置培养：纯化培养时，接种之后萌发出菌丝，菌丝相互交织成网，1～2d内形成伸展充满整个容器液面的白色薄膜，成为菌丝垫或菌垫。在液体培养(250mL三角瓶中50mI，液体培养基)中，厚度约为1．0～1．5mm的菌垫位于气液交界面，便于获得氧。随着培养时间的延长，菌垫与空气接触的表面会形成白色粉状物——孢子。若培养时间(10d)更长一些，菌垫表面会形成绿色粉状物——孢子。

②振荡培养：菌种接种后，萌发的菌丝在一定的摇速作用下相互缠绕成团，1～3d形成在容器里随机碰撞的白色小球，成为菌丝团或菌团，如图3—3所示。

2．个体形态特征

主要是形态观察，进行芽孢染色。芽孢染色方法如微生物的形态研究中所述事孢染色如图3-4所示。

显微镜观察菌丝，菌丝的形态与菌种的生理状态相关。在培养的初期(10d)菌丝较长，有的呈螺旋状，无侧分枝，如图3-5所示。

3．生理生化反应

黄孢原毛平革菌的特征反应如微生物的形态研究中所述。试验中，在培养皿中接种白色绒状菌落，用加入琼脂及少量单宁酸的专项培养基，温度控制在30℃。经过3d培养后，在菌落外侧形成了肉眼可见的褐色轮环，如图3-6所示。

白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素

饲料研究FEED RESEARCH NO .5,2011 15 综述 白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素 张爱武1 董 斌2 康 伟11.吉林农业大学中药材学院2.沈阳鑫育隆饲料有限公司 收稿日期：2010 - 12 - 21 基金项目：吉林省长春市科技计划项目（09YJ21）通信作者：张爱武 农作物秸秆是世界上数量最多的农业生产副产品之一。据联合国环境规划署报道，世界上种植的农作物每年可提供各类秸秆约20亿t。我国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一，主要的秸秆约20种，而且数量巨大。目前秸秆的利用仍以原始利用为主，且利用方式单一，其中玉米秸秆分布广且数量多，利用潜力最大。由于目前用作饲料的数量还不到秸秆总量的10 ％，秸秆还田和副业加工利用等不到5 ％，大部分被浪费掉。麦秸和稻草等用作饲料的就更少。农作物秸秆由于营养品质低下，适口性差等原因，在饲料方面的利用率很低。饲喂反刍动物时，需对秸秆进行预处理，以提高其营养价值和适口性。基于我国国情，虽然物理和化学处理方法对秸秆品质均有较大改善，但是由于实际生产中成本、操作和环境污染等方面原因，推广使用范围较小。一系列的实验室研究和饲养试验表明：利用微生物降解方法处理秸秆具有广阔的前景。 利用微生物可转化秸秆，因为微生物能利用和分解多种畜禽不能利用的复杂有机化合物，合成含有丰富蛋白质和脂肪的菌体细胞，这些分解产物和菌体可用于饲料。微生物在秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短和可再生等优点，越来越受到国内外研究者重视。国内研究使用较多的是以乳酸菌-纤维分解菌-丙酸菌为主的微生物活菌制剂。自70年代以来，国外许多学者和研究人员致力于白腐真菌的研究。白腐真菌是一类丝状真菌，因腐生在树木或木材上，引起木质白色腐烂而得此名。它依靠降解木质纤维材料的能力穿入木质，侵入木 质细胞腔内，释放降解木质素和其他木质组分的酶，导致木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐。分类学上，白腐真菌属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。白腐真菌分布十分广泛，无论高山或平原，凡是有树木生长、存放或使用木材的地方都有分布。各地区白腐真菌种类的变化常随树木种类与气候诸多条件而改变。 1 白腐真菌降解秸秆的效果 早在20世纪70年代，国外就比较重视对白腐真菌的研究。我国近来利用白腐真菌降解秸秆的研究已有所进展。白腐真菌通过次生代谢物包括，各种胞外酶、过氧化物酶、二价锰过氧化物酶及漆酶的催化作用有效降解木质素。王连稹报道，白腐菌处理秸秆主要是由于其在生长活动过程中能分泌多种酶，这些降解酶主要是木质素降解酶，其次是纤维素降解酶及半纤维素降解酶，以降解细胞壁物质中的木质素、纤维素及半纤维素。已知的白腐真菌包括，栓菌属、平革菌属、侧耳菌属、半胶菌属和黑管菌属等；常见的包括，长绒毛栓菌、云芝、黄孢原毛平革菌、糙皮侧耳菌、紫半胶菌、黑管菌和裂褶菌等，国际上很多研究者发现，有降解能力的是黄孢原毛平革菌，属非褶菌目、伏革科和显革菌属。Zadrazil 等(1984) 对包括桦多孔菌、漏斗状侧耳、云芝深褐色次革菌、辐射卧孔菌、粉状侧孢霉和拟革盖菌等200个品系进行筛选后发现，有几十种白腐真菌能显著改善秸秆的适口性，提高木质素的降解率，大幅度提高秸秆的瘤胃干物质消化率，从而使秸秆成为反刍动物的一种含较高营养价值的廉价能量饲料。 有关香菇菌的研究报道，香菇和平菇等木腐类真菌分解木质素和纤维素的能力较强，这类食用菌

白腐菌液体菌种培养条件的试验研究_吴薇

Ｎｏ．１．２００８ 收稿日期：２００７－０７－２０＊通讯作者 基金项目：中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项。 作者简介：吴薇（１９７０—），女，浙江人，博士研究生，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏工程和生物质材料工程。 吴 薇１，顿宝庆２，姜训鹏１，吕程序１，高振江１＊，路明２＊ （１．中国农业大学工学院，北京１０００８３；２．中国农科院生物质能源研究中心，北京１０００８１） 摘要：对３种白腐菌的液体菌种培养条件进行了优化研究。结果表明，黄孢原毛平革菌液体菌种培养的较优条件为培养时间４ｄ、初始ｐＨ６．０、装量５０ｍＬ、琼脂添加量０．２％，Ｗ３液体菌种培养的较优条件为培养时间５ｄ、初始ｐＨ６．５、装量５０ｍＬ、琼脂添加量０．３％，变色栓菌液体菌种培养的较优条件为培养时间５ｄ、初始ｐＨ６．５、装量７５ｍＬ、琼脂添加量０．１％。关键词：白腐菌；液体菌种；培养条件中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５－９９８９（２００８）０１－００１６－０３ 白腐菌液体菌种培养条件的 试验研究 Ｓｔｕｄｙｏｎｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉ ＷＵＷｅｉ１，ＤＵＮＢａｏ－ｑｉｎｇ２，ＪＩＡＮＧＸｕｎ－ｐｅｎｇ１，ＬＶＣｈｅｎｇ－ｘｕ１，ＧＡＯＺｈｅｎ－ｊｉａｎｇ１＊，ＬＵＭｉｎｇ２＊ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆ ＥｎｅｒｇｙＳｏｕｒｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ， ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｔｕｄｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉｉｎｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｆｉｅｌｄｓｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｉｎａｌａｒｇｅｅｘｔａｎｔ． ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｎｌｉｑｕｉｄｓｔｒａｉｎｏｆＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｗａｓ４ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｐＨ６．０，ｌｉｑｕｉｄｃａｐａｃｉｔｙ５０ｍＬ，ａｇａｒｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ０．２％．Ｔｈｅ 提高海藻糖的百分含量。 将海藻糖和三氯乙酸混合液用３倍体积的９５％乙醇在４℃冰箱中醇析１２ｈ后，在５０００ｒ／ｍｉｎ下离心２０ｍｉｎ得到沉淀物。将此沉淀物冷冻干燥１２ｈ后，可得海藻糖晶体。 参考文献： ［１］ＥｌｂｅｉｎＡＤ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆα，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ［Ｊ］．ＡｄｖＣａｒｂｏ－ｈｙｄＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ，１９７４，３０：２２７－２５６ ［２］戴秀玉，程苹．海藻糖的生理功能、分子生物学研究及应用前景［Ｊ］．微生物学通报，１９９５，２２（２）：１０２ ［３］程池．天然生物保存物质———海藻糖的特性和应用［Ｊ］．食品与发酵工业，１９９６，２２（１）：５９－６４ ［４］ 刘洋，张红缨，张今．酵母菌中海藻糖的提取方法与糖代谢研究［Ｊ］．吉林大学自然科学学报，１９９８，（４）：８５－８８ ［５］章银良，毛多斌，张勋．产海藻糖酿酒酵母培养基优化及生理学研究．生物技术，２００１，１１（６）：２７－２９ ［６］ 章银良，熊卫东，张露，等．胁迫条件下酿酒酵母积累海藻糖的发酵研究［Ｊ］．郑州轻工学院学报（自然科学版），２００３， １８（２）：５０－５２［７］ＪｏｈａｎＭＴ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖｉｅｗ［Ｊ］．１９８４，４８（１）：４２－５９［８］ ＪｏａｏＡＪ，ＭａｒｉａＤＬ，ＰｏｌｉｚｅｌｉＴＭｅｔａｌ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ－ｇｙＬｅｔｔｅｒ，１９９７，１５４：１６５－１７１ ［９］ＣａｒｍｅｎＬＡＰ，ＡｎｉｔａＤＰ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ， １９９６，（２）：２９３－３１４ ［１０］ＫｏｋｉＳ，ＴｏｓｈｉｙａＫ，ＥｉｉｃｈｉＴｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ－ ｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（１１）：４３４０－４３４５ ［１１］ＳＪＳｔａｓｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，ＲＪＳｅｖｉｏｕｒ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｏｌｙｓａｃ－ ｃｈａｒｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＦｕｎｇｕｓＡｃｒｅｍｏｎｉｕｎｐｅｒｓｉｃｉｕｍｗｉｔｈｆａｔｔｙａｃｉｄｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈａｎｄＢｉｏｅｎｇｉ，１９９０，３６：７７８－７８２ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 食品开发与机械 １６

黄孢原毛平革菌培养实验要点

黄孢原毛平革菌的培养实验 关键词：显微镜三角瓶 ATCC 北京标准物质网 一、黄孢原毛平革菌 试验所用菌种黄孢原毛平革菌BKM-F-1767，密封，置于冰箱中。 二、黄孢原毛平革菌的培养基 1．黄孢原毛平革菌培养基的组成 基本培养基：2.Og 马铃薯浸出液，20g 葡萄糖，3g KH 2PO 4 ，1．5g MgSO 4 ·7H 2 O， 0.1mg FeSO 4·7H 2 O，0.2mg CuSO 4 ·5H 2 O，8mg 维生素B1，用蒸馏水定容到1000mL。 斜面孢子培养基：采用改良PDA培养基(L-1)：200g 马铃薯浸出液，20g 葡 萄糖，20g 琼脂，3g KH 2PO 4 ，1.5g MgSO 4 ·7H 2 O，0.1mgFeSO 4 ·7H 2 O，0.2mg CuSO 4·5H 2 O，8mg 维生素B1。 2．培养基的消毒灭菌 为了对微生物进行纯培养，防止杂菌污染，必须对微生物生长的培养基进行消毒灭菌。培养基的消毒灭菌步骤如下：将装有液体培养液的锥形瓶塞上棉塞，罩上牛皮纸，用线扎紧。首先在高压灭菌锅内放水，使水面超过加热电阻丝两指左右，放置好锅内桶，在锅内放入待灭菌的培养基和需消毒的物品，盖好锅盖，拧紧螺钉，打开放气阀。然后接上电源，待水烧开3min后(将锅内冷空气赶出后)，关闭放气阀，待压力升高。当温度指到121℃，压力为0．1 5MPa时，使温度压力恒定。从这时计时25min，关掉电源，等锅内温度冷却下降至0℃刻度，打开放汽阀放气，打开锅盖．再取出培养基及消毒物品。至此，消毒灭菌完毕。 所谓“白腐真菌”，并非生物学上的概念。 第一，它不属于生物系统分类学范畴的术语，而是从功能角度上对生物进行描述和界定。 第二，它既不专指某一种真菌，也不泛指某一些真菌，而是限定为一类腐生在木质上有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化——白腐的丝状真菌的总称。

白腐真菌在环境保护中研究与应用进展

摘要综述了近年来白腐真菌在环境保护中的研究进展，主要包括在多种工业废水处理、垃圾堆肥及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的应用。关键词 白腐真菌 环境保护 应用 中图分类号 Ｘ７０３．１ＴＱ０８５＋．４１３ 白腐真菌在环境保护中研究与应用进展 吴林林 阮宇鹰 武琳慧黄民生 华东师范大学环境科学系（上海 ２０００６２） 环境保护 ０前言 环境中难降解有机污染物日积月累并持久存在 的结果已严重危害生态系统的健康和人类社会的可持续发展。这些污染物产生于各种工农业生产及人类生活活动中，除难以降解外它们还具有较高的生物毒性和致癌、致畸、致突变危害性，是环境治理与保护工作的重点和难点。白腐真菌通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等关键酶催化自由基链式反应，对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。自２０世纪８０年代以来，国内外许多学者开始应用白腐真菌进行环境治理与修复的实验和应用研究。本文对白腐真菌在多种工业废水处理、垃圾及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的研究与应用进展进行了综述。 １ 白腐真菌在工业废水处理中的研究与应用 １．１ 造纸废水处理 吴涓等研究了不同白腐真菌对灰法造纸黑液废 水的处理效果，考察了黑液废水浓度和碳氮源添加量对黑液脱色及ＣＯＤＣｒ去除率的影响。研究结果表明，变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｃｏｌｏｒ）对黑液废水的 ＣＯＤＣｒ和色度的去除率分别达到６４．２５％和４７．３１％， 在添加０．２％纤维二糖和０．０２％天冬酰胺的情况下应用自行分离、筛选的白腐真菌（ＡＨ２８－２）处理黑液废水时ＣＯＤＣｒ去除率也达到了６０％以上。该研究还发现，锰过氧化物酶（ＭｎＰ）和木质素过氧化物酶（ＬｉＰ）酶活相对比值对造纸黑液的ＣＯＤＣｒ去除率有明显影响，ＭｎＰ／ＬｉＰ酶活比值越高时ＣＯＤＣｒ去除率也越高，说明在该降解系统中ＭｎＰ起到主要作用［１］。 Ｍａｒｗａｈａ等分别采用黄麻绳、棉花和小麦作为黄孢 原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ，简称ＰＣ菌，下同）生长、挂膜载体在厌氧条件下对造纸黑液进行预处理，结果表明，以黄麻绳为载体时废水的脱色率和ＣＯＤＣｒ去除率最高，相应的运行参数为温度４０℃、ｐＨ５．５、 菌丝体负荷３４０ｍｇ、外加葡萄糖浓度１％（ｍ／ｖ）、 停留时间７２ｈ。Ｊｏｙｃｅ等应用ＰＣ菌构建新型生物转盘（ＭｙＣｏＲ反应器，即真菌生物转盘反应器）来处理纸厂漂白废水。实验结果表明，这种生物转盘能够有效降低白水的ＣＯＤＣｒ和ＢＯＤ５并使氯化木质素脱氯。秦文娟等［２］将几种不同的白腐真菌菌丝悬浮液与海藻酸钠、氯化钙混合后凝固成球状，用于造纸Ｅ段氯漂废水的脱色处理，结果发现Ｐｏｌｙｓｔｉｃ－ ｔｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ和Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔｅ两种ＰＣ菌对废水的 脱色效果最好（２４ｈ内废水色度下降５０％左右）。王双飞等在８％ＰＶＡ、０．５％海藻酸钠、３％细胞浓度的条件下制备固定化ＰＣ菌间歇式处理造纸Ｅ段氯漂废水。实验结果表明，在连续运行１个月内，处理效果稳定，废水的脱色率保持５０％左右，ＴＯＣ去除率分别保持５０％～５８％，比游离态ＰＣ菌间歇式连续处理分别高出１７％和１２％。 １．２染料及印染废水处理 张朝晖等应用ＰＣ菌生物膜反应器进行酸性染 料卡布龙红和弱酸大红的降解实验。结果表明，在限碳培养条件下挂膜培养５ｄ后，木素过氧化物酶活力达到最高，此时分别加入酸性染料卡布龙红和弱酸大红，质量浓度分别为２５、５０、１００ｍｇ／Ｌ和１２．５、 ２５、５０ｍｇ／Ｌ，４８ｈ后培养液基本脱色，较高浓度下菌膜上有少量吸附的残余染料，５ｄ后染料质量降解 率分别为１００％、８８％、９２％和５８％、６５％、３８％［３］。 李慧第一作者简介：吴林林男１９８１年生华东师范大学环境科学系在读硕士主要从事水污染控制与生物修复研究 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．１Ｊａｎ．２００６ 上海化工 ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ ８??

印染

白腐真菌对染料废水脱色及降解的研究进展 环境081 刘冰星0810240122 摘要：系统介绍了白腐真菌对染料脱色和降解作用的研究进展、脱色机理及其影响因素，旨在为以后 真菌对染料废水的脱色及降解提供参考和依据． 关键词：白腐真菌；染料；脱色及降解；机理 在所有的工业废水中，来自染料工业和印染行业的染料废水是最难处理的工业废水之一，这是因为染料是一种化学结构复杂的化合物，它含有人工合成的复杂的芳香烃分子结构很难被除去．据报道，商业染料的种类约有10万种，每年染料的总产量为7×10 t，我国年产量已达1．5×10 t，这其中大约有10％～15％的染料会直接随废水排入环境当中，这种现象在我国更为严重．染料具有高度的稳定性，难被生物降解，在环境中可以存留很长时间，染料的颜色是造成染料废水高色度的原因，从而它们产生视觉污染，使水体透明度下降，并且许多染料是由一些致癌物质(例如苯胺及其他芳环物质)合成，因此染料废水必须进行处理． 染料废水通常通过物理或化学方法处理，主要包括吸附法、絮凝沉淀技术、化学氧化法、离子交换技术、超滤膜技术、光催化技术等，然而，这些技术对废水中色度的去除效果不太明显，并且处理费用高，处理废水的范围较窄，所以众多学者都把研究焦点集中在微生物对染料废水的处理上．近几年，已有大量可以降解或吸附染料的微生物的报道，这些微生物包括细菌、真菌和藻类． 自然界中白腐真菌(white rot fungi)是一种重要的生物资源，它们对木质素具有良好的降解能力．Eaton 等L5 于1980年将白腐真菌应用到对造纸废水和印染废水的处理中，此后许多研究证实了白腐真菌在废水处理中是很有发展前景的微生物．其中研究最多的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)．白腐真菌产生的细胞外酶(包括木质素过氧化物酶Lips和锰过氧化物酶Mnps)被认为是降解木质素和染料的特殊酶系L4 J．这些酶具有非特异性、无需底物诱导的特殊性能，对许多结构不同、高度稳定、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。本文综述了白腐真菌对印染工业中染料的脱色研究，讨论了其脱色机理及其影响因素，旨在为以后染料废水的生物处理提供依据． 1 白腐真菌的生物学背景、种类及培养特性 1．1 白腐真菌的生物学背景 木腐真菌寄生或腐生在木材上，能释放降解性酶降解木质素、纤维素，侵入木质细胞腔内获取营养，导致木材腐朽，成为海绵状团块．根据腐朽后团块颜色分为白腐真菌和褐腐真菌Ll ．白腐真菌多为担子菌纲(Ba—sidiomycetes)．多数的多孔菌、伞菌都属于这一类型．《中国真菌志》(多孔菌科卷)记载了46属137种，其菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合，多核的分生孢子常为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统 1．2 白腐真菌的种类’ 白腐真菌的种类很多，其中典型的有如下几种：黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，Tinc— toporia sp．，特罗格粗毛盖菌(Funalia trogii)，Trametes hirsute，采绒革盖菌(Trametes versicolor)，烟管菌 (Bjerkandera sp．)，Pleutrotus ostreatus，杂色云芝(coriolus versicolor)，朱红密孔菌(Pycnopororus cinnabar—i )等，

难降解有机物对白腐真菌P450的诱导及P450的作用

中国环境科学 2009,29(4)：407~412 China Environmental Science 难降解有机物对白腐真菌P450的诱导及P450的作用 宁大亮1,王 慧1*,王立华1,2,丁 昶1(1.清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京 100084；2.河北北方学院理学院,河北张家口 075000) 摘要：实验考察了多环芳烃和氯酚类化合物对黄孢原毛平革菌P450的诱导作用及其P450对生物降解的影响.结果表明,萘、菲、2,4-二氯酚、五氯酚能够诱导该真菌P450,使微粒体P450比浓度达到37~137pmol/mg.在营养限制条件下,菲诱导的P450是营养丰富条件的5.7倍;P450抑制剂的作用使萘、菲、芘、2,4-二氯酚的降解效率下降36%~100%,但是对2,4,6-三氯酚和五氯酚的降解未产生影响.在营养丰富条件下,P450抑制剂的作用使萘、菲、芘、2,4,6-三氯酚的降解效率下降47%~100%,使五氯酚的降解效率增大57%,但对2,4-二氯酚的降解未产生影响. 关键词：白腐真菌；P450；多环芳烃；氯酚；诱导 中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2009)04-0407-06 Induction and function of cytochrome P450 in degradation of refractory organic chemicals by Phanerochaete chrysosporium. NING Da-liang1, WANG Hui1*, WANG Li-hua1,2, DING Chang1 (1.State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China；2. College of Science, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China). China Environmental Science, 2009,29(4)：407~412 Abstract：The involvement of P450 in degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and chlorophenols by white rot fungus Phanerochaete chrysosporium was investigated. The significant induction of P450s by naphthalene, phenanthrene, 2,4-dichlorophenol and pentachlorophenol were observed. The specific concentrations of microsomal P450s were up to 37~137 pmol/mg in the induced cells. The content of phenanthrene-induced P450 from nutrient-limited culture was 5.7 times higher than that from nutrient-sufficient culture. Piperonyl butoxide (PB), a P450 inhibitor, markedly inhibited the degradation of naphthalene, phenanthrene and pyrene in both nutrient-limited and nutrient-rich culture medium. Moreover, in nutrient-limited culture medium, PB inhibited 2,4-diclorophenol degradation but had no effect on degradation of 2,4,6-triclorophenol and pentachlorophenol. In nutrient-rich culture medium, in contrast, PB inhibited 2,4,6-triclorophenol degradation but did not affect 2,4-diclorophenol degradation. The degradation of pentachlorophenol was even elevated with the presence of PB in nutrient-rich cultures. Key words：white rot fungus；P450；polycyclic aromatic hydrocarbons；chlorophenol；induction 白腐真菌是一类可降解木质素、营腐生生活的白色丝状真菌，能够降解许多难降解有机污染物,其胞外木质素降解酶一直是环境领域研究热点[1].近年来,白腐真菌细胞内的细胞色素P450的降解功能越来越引起人们的关注.P450是一类含高铁血红素IX的单加氧酶,在许多生物体中参与多环芳烃、多氯联苯、农药等多种难降解污染物的降解[2].白腐真菌中的黄孢原毛平革菌拥有150多个功能未知的P450基因[3],是迄今所知的P450基因最丰富的真菌. 白腐真菌能够依赖胞内酶降解一些多环芳烃[1],其P450基因的表达也受多环芳烃的诱导[4];白腐真菌降解三氯酚[1]、五氯酚[5]的过程中胞内酶的作用也很重要;在动物和部分微生物中多环芳烃和氯酚类物质的代谢几乎都与P450有关[2,6].但是目前除了糙皮侧耳菌的P450对菲的 收稿日期：2008-09-16 基金项目：国家“973”项目(2004CB418506);国家自然科学基金资助项目(30400012) * 责任作者, 副教授,wanghui@https://www.wendangku.net/doc/826353139.html,

白腐菌

野生白腐菌分离与纯化的初步试验 前言 白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌,能够分泌胞外氧化酶降解木质素,且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力,这些酶可以促使木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐,故称为白腐真菌 白腐菌: white rot fungi 定义: 属担子菌纲丝状真菌，因腐朽木材呈白色而得名。代表菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，在污染土壤修复中常有应用。 白腐菌是属于担子菌亚门的真菌,因腐朽木材呈白色而得名，是能够降解木材主要成分的微生物之一。木材在白腐过程中大部分纤维仍保持完整，且纤维素结晶度变化不大。由此设想利用对降解木质素选择性好的白腐菌进行生物制浆，能开辟制浆方法的新途径。白腐菌除了能降解木质素用于预理、生物漂白、生物制浆外，对其它有机异生物质也有很强的分解能力，因而在废水处理中也有广泛的应用前景。 为降低制浆能源消耗，可在制浆之前依靠白腐菌对木质素进行分解和改性，用选择过的微生物培养基对原料进行预处理。通过白腐菌对原料的预处理，可降低后阶段制浆能耗的50%，并且纤维强度性能也得到改进。 白腐菌预处理制浆不仅在木质材料制浆当中应用研究较多，在非木质制浆原料(如芦苇、蔗渣、剑麻、黄麻等)预处理制浆中的应用研究同样广泛。 可以看出，白腐菌预处理在硫酸盐法、碱法、机械法和烧碱-蒽醌法等制浆方法中都可以不同程度地降低制浆成本、提高纸张质量。但是菌种筛选困难和预处理周期较长是制约白腐菌应用的最大障碍，大规模应用于制浆预处理还需要相关方面技术的突破。 利用白腐菌可以降解木质素、半纤维素和纤维素的特性，白腐菌在制浆造纸各个环节的应用都得到了很广泛的研究，但是利用白腐菌直接制浆却鲜见报道。筛选对纤维素没有影响或影响较小的选择性极高的白腐菌种直接处理原料制浆是一个新的研究方向。20世纪90年代末，日本神户制钢所应用白腐菌在常温常压下分解木材成功制出优质纸浆。选定适宜温度，可以分解出80%的木质素，比一般化学制浆法成本降低了50%。这种白腐菌对木质素的脱除分解率极高，而对纸浆纤维中的纤维素分解极少，这样可使纸浆得率高达60%，超过化学法得浆率的50%。据此计算，木材的消耗量可节约1/9。此种制浆方法将是传统制浆方法的巨大挑战。同样，制浆周期长、白腐菌筛选困难是大规模生产的最大障碍。 在造纸工业中，为了使最终产品的白度既高又稳定，必须把浆中残余木质素所造成的棕黑色通过漂白来除去。用生物方法脱除浆中的残余木质素是现阶段人们研究最多的一种方法，普遍认为白腐菌是最有效的菌种。

真菌吸附金属离子

表面活性剂处理过的真菌吸附水溶液中重金属离子 1. 实验背景和目标 近年来,生物吸附重金属的方法以其材料来源广泛、成本低、吸附速度快、吸附量大、选择性高、易回收等特点,引起了国内外的广泛关注.很多研究表明：黄孢原毛平革菌和简青霉对水溶液中金属离子（Pb2+，Cr6+…）具有良好吸附作用。由于细胞表面的衣鞘（分泌的胞外聚合物等组成），细胞壁，细胞膜上以及细胞内有很多能吸附重金属离子阳离子的阴性基团。 死菌也可以吸附重金属，甚至比活菌的吸附效率更高，同时还避免了由于重金属离子对活体细胞的毒性而使其应用受到限制的问题，因此，其操作更容易和应用更广泛。死菌吸附主要是由于细胞壁表面一些化学基团的络合、配位作用与金属离子形成离子键、共价键。 一般认为，表面活性剂与细胞膜中的脂质和蛋白质相互作用，引起细胞膜通透性的增加,促进细胞内次生代谢物的释放，一方面能降低次生代谢物对其自身合成的反馈抑制，提高产量，另一方面有利于产物的分离纯化和连续生产，提高生产效率，降低成本。研究表明：185～190 mg/L 的Triton X - 100 可使细胞膜和液泡膜渗透率均提高90 % ，但对细胞生长有一定影响。Tween - 20 为非离子型表面活性剂，对悬浮培养的细胞作用比较温和，其分子上的聚氧乙烯基能够与极性分子(如紫草宁) 结合,起到增溶作用；同时，Tween 20 的亲水亲油平衡值高于吐温其它类型，其亲水性较强，增溶效果更明显，因而应用广泛。此外，吐温还可能有利于提高某些酶的稳定性和催化能力，但高浓度的吐温对细胞活力有很大影响，因此要注意表面活性剂的添加浓度和添加时间。还发现使用适当浓度的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide) 显著促进次生代谢物从细胞的释放，或者促进次生代谢物合成。用Tween - 20 和Triton X- 100 处理野葛悬浮细胞能够显著提高细胞培养物的生物量，随着处理浓度加大,提高生物量的作用增强。而浓度为1 %～5 %的Tween - 20 和Triton X - 100 分别处理野葛悬浮细胞3d后，细胞和培养液的颜色逐渐深于对照，培养物研磨后粉末粘连呈絮状，不易过筛，可能对细胞有伤害。抑制作用。 本研究的目的是确定表面活性剂对真菌生长代谢的影响，并对其机理进行探讨。重金属的吸附实验是为了使这种影响具体化。 2. 实验准备 2.1 实验须知： 三种ST的CMC： CMC-Triton X-100=0.31mM=（0.31×646.86）=200.5 mg/l＝0.02％；

黄孢原毛平革菌预处理对酒糟酶解效果的影响

DOI ：10.13746/j.njkj.2018149 收稿日期：2018-05-24作者简介：裴芳霞（1988-），女，甘肃定西人，检验员，E -mail ：1360771490@https://www.wendangku.net/doc/826353139.html, 。 优先数字出版时间：2018-08-07；地址：https://www.wendangku.net/doc/826353139.html,/kcms/detail/52.1051.TS.20180807.1614.002.html 。 黄孢原毛平革菌预处理对酒糟酶解效果的影响 裴芳霞 （黔南州粮油质量检测中心，贵州都匀558000） 摘要：为促进白酒糟生物质的酶解糖化，筛选出适宜的预处理条件，以脱除木质素，提高综纤维素 （纤维素、半纤维素之和）保留率为目标，研究了黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chaysosporium ）生长曲线 及预处理时间对酶解效果的影响。研究结果发现：在P .chaysosporium 接种量为3%，培养时间为8d 时， 酶解液中还原糖、木糖得率达到最大，分别为60.55%和21.33%；综纤维素的保留率和木质素的降解率 分别为76.85%和26.44%；电镜扫描（scanning electron microscope ，SEM ）及X 衍射（X -ray differaction ， XRD ）结果显示，酒糟经P .chaysosporium 处理后酒糟结构发生明显变化，木质纤维网络结构遭到破坏， 表面呈现无规则或形状各异的膨松状，沟壑明显，孔隙率增加，比表面积增大，有利于提高水解酶的可 及性。 关键词：酒糟；黄孢原毛平革菌；预处理；酶解糖化 中图分类号：TS262.3；TS261.1；TS261.9文献标识码：A 文章编号：1001-9286（2018）09-0081-05 Effects of Phanerochaete chrysosporium Pretreatment on Enzymatic Saccharification of Distillers Grains PEI Fangxia (Qiannan Grain and Oil Quality Testing Center,Duyun,Guizhou 558000,China) Abstract :Distillers grains (DG),composed of unhydrolyzed and unfermented polymeric sugar,is the co-product in distilleries.In this study,the effects of Phanerochaete chaysosporium pretreatment on enzymatic saccharification of distillers grains were explored.The results suggested that,as the inoculating quantity of P .chaysosporium was 3%and the culture time was 8d,the yield of reducing sugar and xylose reached the maximum of 60.55%and 21.33%,and the holocellulose retention rate and lignin degradation rate were 76.85%and 26.44%respectively.Besides,SEM and XRD results revealed that there were significant changes in the structure of dis-tillers grains after P .chaysosporium pretreatment including destroyed wood fiber network structure,irregular puffing state in various shapes,and increasing porosity etc.,which were helpful for enzymatic saccharification of distillers grains. Key words :distillers grains;Phanerochaete chaysosporium ;pretreatment;enzymatic saccharification 随着化石能源的日益枯竭，生物能源的开发不 仅有助于缓解日益严重的能源危机，还能减轻对地 球温室效应和雾霾天气影响。木质纤维生物质各 组分结构复杂，彼此关联。纤维素和半纤维素链内 和链间主要通过氢键连接，木质素内部除了有强大 的氢键连接外，还与半纤维素形成稳定的木质素- 碳水化合物复合体。三者相互交织的结构决定了 任何一类成分的降解必然受到其他成分的制约，如木质素对纤维素和半纤维素酶解过程的空间位阻作用，很难使水解酶直接作用于底物，导致酶解效率和糖得率较低[1]。因此，需要通过预处理技术破坏木质纤维素的致密结构，改变木质素与半纤维素周围的基质结构，提高酶与底物的接触面积，使其在酶作用下降解为可发酵糖，这也是燃料乙醇转化 酿酒科技2018年第9期（总第291期）·LIQUOR -MAKING SCIENCE &TECHNOLOGY 2018No .9(Tol .291)81万方数据