cDNA文库的构建
cDNA文库的构建
https://www.wendangku.net/doc/a74932522.html, 时间：2006-9-10 来源：生命经纬
分为六个阶段：
阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]
1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl22μl
dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl
0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制剂（选用）25单位
加H2O至48μl
2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA 分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：
[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)
7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段2：cDNA第二链的合成]
1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：
10 mmol/L MgCl270μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000单位/ml) 1μl
大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4
h。
2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl
室温温育15min。
3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。
4．取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。
5．将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将D NA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6．将下列试剂加到DNA溶液中：
10×T4多核苷酸激酶缓冲液10μl
T4多核苷酸激酶（3000单位/ml）1μl
室温温育15分钟。
7．测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法测定1μl第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8．用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。
[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二链合成量/μg
x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的70~80%
9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。
10．Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过
离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
11．加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。
12．用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13．小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。
14．如果需要用Eco R I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl T E(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段3：cDNA的甲基化]
1．在cDNA样品中加入以下试剂：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸1μl
加H2O至96μl
2．取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号，置于冰上。
3．在余下的反应混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶（80 000单位/ml），保存在0℃直至步骤4完成。
4．再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。
5．在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ
噬菌体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。
6．所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。
7．于68℃加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8．在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。
9．按下述方法分析4个小样对照反应：
a.在每一对照反应中分别加入：
0.1 mol/L MgCl22μl
10×Eco R I 缓冲液2μl
加H2O至20μl
b.在2号和4号反应管中分别加入20单位Eco R I。
c.四个对照样品于37℃温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
10．微量离心机以最大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。弃上清，加入200μl 70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11．用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12．尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。
[阶段4：接头或衔接子的连接]
cDNA末端的削平
1．cDNA样品于68℃加热5 min。
2．将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂：
5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液10μl
dNTP溶液，每种5 mmol/L 5μl
加H2O至50μl
3．加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml），37℃温育15min。
4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以终止反应。
5．用酚：氯仿抽提，再通过Sephadex G-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。
6．在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇，样品于4℃至少放置15 min。
7．在微量离心机上以最大速度离心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).
接头-衔接子与cDNA的连接
8．将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：
10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液2μl
800~1000 ng的磷酸化接头或衔接子2μl
T4噬菌体DNA连接酶（105Weiss单位/ml）1μl
10 mmol/L ATP 2μl
混匀后，在16℃温育8~12h。
9．从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃，其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。 [阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制备
1．用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2．将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L Na Cl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
3．在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。
4．将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
依据大小分离回收DNA
5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积5 0μl或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装c DNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
6．用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7．用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。
8．从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20℃，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
9．电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前20min至30min于50℃加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥1~2h.
10．置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。
11．在cDNA长度≥500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4℃以
12 000g离心15min，以回收沉淀的cDNA。
12．将DNA溶于总体积为20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。
13．测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于λ噬菌体臂相连接的DNA总量。
[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二链合成量=可用于连接的cDNA
[阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接]
1．按下述方法建立4组连接-包装反应：
连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。
2．按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。
3．包装反应完成后，在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。
4．预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做100倍稀释，各取10μl 和100μl涂板，于37℃或42℃培养8~12小时。
5．计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应A不应产生重组噬菌斑，而连接反应
B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑。
6．根据重组噬菌斑的数目，计算cDNA的克隆效率。
7．挑取12个重组λ噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。
8．通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小，用长度范围500bp~5kb的DNA
片段作为分子质量参照。
cDNA文库构建原理以及技术路线
CDNA文库 1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控 2. CDNA文库得质量 （1）文库的代表性 CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数 N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为 N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5) 一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量 3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用，其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域，存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息，要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构 4．构建文库的载体系统 （1）入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统，在载体本身地设计方面已经相当成熟，其主要优点是插入片断地装载容量大，适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒，对宿主大肠杆菌地转染效率高，通常1ugCNDA构建出地CDNA文库，转染宿主菌后，都可以得到10（6）－10（7）以上地原始库容量，同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况，有较好地质量控制指标，因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高，代表性好，此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在，这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定，非常适合长期保存，但是可以采用地文库筛选方法很有限，文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。 （2）质粒载体系统 可以功能性筛选：利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础，从文库中分离鉴定
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNＡ文库构建的方法 1．１ mＲNA纯化 构建一个cＤNＡ文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mＲＮA。ｍRNA仅占细胞总RNＡ的1%～5％,因而需要另外的纯化技术来富集ｍＲNA。从细胞总RＮA中分离mRＮＡ是根据实际上所有真核细胞mＲNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为ｐolｙ(A)尾巴，是mRNＡ分子特有的而其他主要RNA 没有，pｏly(Ａ)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(ｄT)）杂交。正是这种特性使得mRＮA从ＲNＡ分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRＮA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~１8碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总ＲNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非pｏlｙ(A)ＲNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱,而是将基质直接加到总ＲNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有ＲＮA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总ＲNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 １.2ｃＤＮA的合成与克隆 1.2.1 cＤNA第一条链的合成 所有合成cＤNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是ｍＲNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶（reｖeｒse tranｓcripｔａse)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNＡａｓeH酶活性。RＮAasｅ H酶活性在反应中起负作用,可降解mRＮA分子末端的polｙ(Ａ)序列和cDNA-ＲNA杂交分子中的RＮA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。ＧIBCO-BＲL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERＳCRIPT反转录酶,缺少C-末端18０个氨基酸,完全去除了其 ＲNAａｓe H酶活性，保持完整的DＮＡ聚合酶活性。 1.2．２ cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/ＲNＡ杂交分子变性,降解RNA，则单链cＤＮA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链ｃDNA，在其相当于ｍRＮA５’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDＮA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mＲNＡ5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4ｍmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI 核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2．3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA)合成后，将此ＤＮA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库
cDNA文库的构建方法与原理
c D N A文库的构建方法与原理 蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。 1．基本原理 cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。 cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途： 首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。 第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。 第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。 第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。 2．基本方法 2．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 2.2 cDNA的合成与克隆
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water （大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4 ul 5×first strand buffer （2）2 ul 0.1 M DTT （3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成
cDNA文库构建简易流程
1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA，加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡 核苷酸以及其它相应试剂，在适当的条件下，经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA 取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂，通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化 双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性，经氯仿:异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。酶切后，过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化，以去除小的片段和杂质，依次收集16管，经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，收集cDNA 含量最高的几管。 4、双链cDNA片段的克隆和体外包装 分级分离纯化的双链cDNA，定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上，在载体量不变的前提下，设定了3个连接梯度反应，连接结束后，3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装，体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测 用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后，分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释，稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液，在37 C进行20min的吸附后，再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂，迅速混匀倒到预热至37℃的平板上，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养，每相隔一段时间后，检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算，公式如下 : 文库的重组率则利用蓝白斑互选进行，在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml)，待噬菌斑长成后，统计蓝白斑的数量，算出重组率。 6、cDNA的PCR快速鉴定 从平皿中直接挑取噬菌斑，用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。 初步结果：按l : 10的比例稀释后滴定，过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少，滴度很低，而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高，符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想，连接效率最高。 紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定，随机挑取10个透明噬菌斑，PCR扩增均有大于500bp的插入片段，进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。
构建cDNA文库应注意的事项
构建全长cDNA文库时应当注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。但都应当注意以下四个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。
cdna文库构建流程
cDNA文库组标准流程 一. Total RNA的提取 (2) 二. mRNA的分离 (5) 三．cDNA双链合成 (8) 四．载体制备 (11) 五. cDNA双链和载体的连接 (13) 六．电转化流程 (14) 七．快速鉴定、菌落PCR (16) 八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)
一.Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠8.25ml 10%肌氨酸钠12.375ml 异硫氰酸胍118.05g 加DEPC水定容至250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） ▲2M 醋酸钠PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温 放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):
CDNA文库构建的注意
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二 者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面：一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot 的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA 进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不 是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子 要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这 是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录， 则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的 一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。 反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相 当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少 部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而 很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建 https://www.wendangku.net/doc/a74932522.html, 时间：2006-9-10 来源：生命经纬 分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl22μl dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl 0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制剂（选用）25单位 加H2O至48μl 2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。 在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。 3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。 5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA 分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）： [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2：cDNA第二链的合成] 1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中： 10 mmol/L MgCl270μl 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）10μl 1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl RNase H (1000单位/ml) 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl 温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4
简述cDNA文库构建的方法(推荐文档)
简述cDNA文库构建的方法 1．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 1.2cDNA的合成与克隆 1.2.1 cDNA第一条链的合成 所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。 1.2.2 cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环，得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠，以抑制发卡结构的形成，这样便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2.3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA）合成后，将此DNA与载体（质粒或噬菌体）组成重组分子，然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文
关于cDNA文库
1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。在获得高质量的mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断，扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA 全长，建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体，是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA 文库不仅能提供完整的mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH 公司的SMART cDNA Library Construction Kit 方法或GeneRacer 试剂盒(Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个cDNA 文库中的cDNA 序列是否是全长基因的cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价
cDNA文库及其构建.
cDNA文库 科技名词定义 中文名称：cDNA文库 英文名称：cDNA library 定义：含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。 应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 概述 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA （cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA 克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA 文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。 定义 (cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。原理 经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 cDNA文库构建的注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 保证获得数量足够的高质量的起始RNA 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA 也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非
cDNA文库构建方案
植物生理学与生物化学国家重点实验室（浙江大学） 实验室Protocol汇编 实验室主任：吴平 参编人员：寿惠霞，毛传澡，吴忠长，王首峰，莫肖蓉，刘洪家，易可可，李靖，黄方亮，周洁，何晓薇等 文本编辑：陈铭 (2005年12月15日) ?本实验室版权所有
一． cDNA文库构建方案 mRNA的纯化(PolyATtract mRNA Isolation systemIII Z5300) 准备：65℃水浴或heating block ;灭菌的无Rnase 1.5 ml 塑料试管；灭菌的无Rnase枪头 一．Annealing of probe 1．在一支干净的1.5ml 管中加入0.1-1.0 mg 总RNA，补无Rnase的水到500 ul； 2．65℃,10 min; 3．在RNA管中加 3ulBiotinglated-Oligo (dT) Probe 和 13 ul 20×SSC ，在适温下温和混匀，直到冷却，约要10 min；同时准备0.5×SSC和0.1×SSC. 二．Stock solution Preparation 1．在无Rnase试管中准备1.2 ml 无菌的0.5×SSC(30 ul20×SSC,+1.170ml Rnase-free water); 2．在无Rnase试管中准备1.4 ml 无菌的0.1×SSC(7.0 ul20×SSC,+1.393 ml Rnase-free water); 三．Washing of streptavitin paramagnetic particles 1．温和悬浮塑料试管中的颗粒至颗粒全部被分散，将小管放到Magnetic Stand 使SA-PMPS颗粒层积在管的一边（-30sec） 2．小心去除悬液，不要离心！ 3．用0.5×SSC(每次0.3 ml)洗SA-PMPS颗粒三次，每次用Magnetic Stand 固定，小心移去悬液； 4．用0.1 ml 0.5×SSC 悬浮洗过的SA-PMPS颗粒颗粒。 四．Capture and washing of Annealed Oligo(dT)-mRNA hybrids. 1．将处理的RNA全部加入已经洗过的含SA-PMPS管中； 2．适温沉淀10 min，每1-2 min 温和地颠倒混合一次； 3．将SA-PMPS管放到Magnetic Stand固定，小心去处悬浮液，不要摇动SA-PMPS沉淀； 4．用 0.1 ×SSC 洗颗粒（轻轻将颗粒从管底弹起使所有颗粒悬浮）4次，每次0.3 ml; 最后一次洗颗粒后在不搅动颗粒沉淀的前提下尽可能去除悬浮液。 五．Elution of mRNA 1．用0.1 ml 无Rnase 水将洗过的颗粒沉淀轻轻弹起悬浮； 2．用Magnetic Stand 固定颗粒，将洗脱的mRNA 转移到灭菌的无Rnase 小管，不要将颗粒丢弃！
cDNA文库构建
cDNA文库构建 cDNA文库 [原理]： cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA 链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
250 mmol/L MgCl 2μl 2 dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 O至 48μl 加H 2 2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。 3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。 5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）： [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2：cDNA第二链的合成] 1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中： 10 mmol/L MgCl 70μl 2 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl