猪细小病毒生物学研究进展
猪细小病毒生物学研究进展
陈玉梅; 马丽萍; 周景明
【期刊名称】《《河南农业科学》》
【年(卷),期】2019(048)011
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】猪细小病毒; 生物学特性; 发病机制; 遗传变异
【作者】陈玉梅; 马丽萍; 周景明
【作者单位】郑州大学生命科学学院河南郑州450001
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)属细小病毒科(Parvoviridae)、原细小病毒
属(Protoparvovirus)中的有蹄类原细小病毒1(Ungulate parvovirus 1，
UPV1)[1]。PPV最早于20世纪60年代末被确认为细小病毒科成员，是SMEDI
综合征(Stillbirths,mummification,embryonic death and infertility，SMEDI)即猪死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕的病原体[2]，对养猪业危害极大。一直以来，人们认为PPV的遗传变异性很低，通过接种疫苗可以很好地控制该病毒的传播。
然而，随着不能被经典PPV疫苗的抗血清有效中和的强毒株的出现，人们逐渐意
识到该病毒的多样性比先前预期的要大得多。因此，追踪PPV研究的最新成果，
全面更新对PPV生物学的理解，对于制定PPV的有效防控策略具有重要意义。
1 PPV的分子生物学特性
PPV是一种小的、无包膜的单链DNA病毒，基因组长4～6.3 kb[3]。病毒的2个末端序列形成大约120～200个碱基的复杂回文发夹结构(呈类似的“Y”或“T”形)[4]。PPV的紧凑型基因组只包含2个启动子，共编码7种蛋白质，并利用选择性剪接技术来扩展基因组的编码能力。2种非结构蛋白NS1和NS2是从p4启动
子转录而来，这些蛋白质对病毒复制特别是DNA复制很重要[4]；另外，还可能
含有1种假定的非结构蛋白NS3。PPV的2种结构蛋白(VP1和VP2)从p40启动子转录。二者是从一组嵌套的编码序列中翻译出来的，它们的氨基末端不同，较小的VP2是从与较大的VP1相同的RNA模板中剪接产生的。VP1有729个氨基酸残基，其中氨基末端前120个氨基酸是VP1特有的(VP1 unique region，VP1u)。而PPV的第3种结构蛋白VP3是VP2的翻译后修饰产物。此外，晚期非结构蛋
白(SAT)是由与VP2相同的mRNA启动VP2起始密码子下游的7个核苷酸表达而来的。PPV的外壳是由60个VP1或VP2结构蛋白分子组成的球形结构，呈二十面体对称排列。每个衣壳亚单位由8条反平行β链及1个α螺旋和4个环组成(图1)[4-5]。VP1蛋白大约占病毒粒子的10%，主要在病毒复制和感染细胞时发挥作用，VP2蛋白是PPV的主要结构蛋白，占病毒粒子的60%以上，也是病毒的主要免疫原性蛋白。VP1、VP2基因对于PPV的系统发育至关重要[6]。
图1 PPV VP2蛋白3D模型(A)及病毒衣壳结构(B)Fig.1 3D model of PPV VP2 with the cartoon technique(A) and the structure of PPV capsids(B)
2 PPV发病机制
PPV毒株毒力是由其可能引起的繁殖失败的严重程度来定义的[7]。大多数情况下，未怀孕成年猪或仔猪单纯感染PPV不会出现临床症状，而胎儿感染的结果随母猪
妊娠的进展而变化，流行病学研究表明，母猪妊娠前半期PPV感染可导致生殖衰竭，PPV经口服途径初次感染母猪后23～32 d穿过胎盘，经肌肉注射途径感染时
间稍短，约15 d[8]。研究发现，仅在胎儿产生抗体前发生的感染才会导致死亡和木乃伊化，妊娠70 d后，胎儿产生抗体反应，通常在这一时期以后的感染胎儿可以存活(图2)[2]。除感染时间外，病毒的遗传组成对胎儿感染的结果有决定性影响，低致病性毒株和疫苗株(如NADL-2和MSV)不能像高致病性毒株(如Kresse毒株
和27A毒株)一样有效地穿过胎盘屏障[7]，因此，不易检测到它们对妊娠的影响。然而，直接向羊水中注射NADL-2毒株可导致胎儿死亡[9]。而关于PPV如何通过胎盘屏障诱导生殖失败还不清楚，没有证据表明PPV可在子宫上皮中复制，因此，通过屏障复制理论不成立[7]。单核细胞和腹腔巨噬细胞可吞噬NADL-2，据此有
研究者猜测PPV可通过母体巨噬细胞侵入胎儿[10]。事实上，目前并没有任何直
接证据表明巨噬细胞可以将PPV从母亲直接传递到胎儿。
用不同毒株PPV感染妊娠母猪的试验表明，NADL-8毒株要达到可经胎盘妊娠感
染所需的毒量是NADL-2毒株的10 000倍以上[11]。而PPV不同毒株感染的胚
胎中病毒DNA的组织分布和数量存在显著差异，在肝脏中通过原位杂交试验检测到Kresse毒株和NADL-8毒株，而在大脑和脾脏仅检测到Kresse毒株[12]。实
时荧光定量PCR检测结果显示，PPV 27a分离株在包括结肠、十二指肠、空肠、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胸腺、性腺等10个不同胎儿器官中的病毒滴度在1011～1015拷贝/106个细胞，而毒性较小的PPV-143a毒株和疫苗株(NADL-2毒株和MSV毒株)主要在肾脏中检出，且病毒滴度较低(<103拷贝/106个细胞)[9]。相关研究结果表明，PPV毒株的组织特异性及其在胚胎中感染起始能力的差异可能在胎儿感染及致病性方面发挥重要作用[9-12]。
图2 PPV感染和免疫应答的主要时间点Fig.2 Major time points of PPV infection and immune response
3 PPV与细胞的相互作用
在乳猪和老年猪体内靶细胞中检测PPV比较困难。研究显示，PPV可以在活化的
淋巴细胞中复制，但不能在血液单核细胞中复制，而在巨噬细胞中的复制能力还存在争议[2]。PCR检测发现，PPV可在心脏、肺脏、肾脏、脾脏、子宫内膜和小肠的细胞中繁殖，然而，PCR检测却不能区分是器官自身细胞中产生的病毒还是通
过血液循环系统运输的病毒[9,13]。PPV进入细胞的第一步是病毒离子与细胞表面糖蛋白的末端唾液酸位点结合，胞吞作用抑制剂阻断试验结果表明，除了网格蛋白介导的内吞作用和大胞饮作用外，还有第3种未知的进入机制可能参与PPV入胞，而小窝蛋白(Caveolae)介导的内吞途径不起任何作用，单个PPV颗粒倾向于通过
网格蛋白介导的内吞作用进入胞内，而PPV聚集物倾向于大胞饮作用[14]。核内
体易位到晚期核内体或溶酶体以及感染后2～10 h的酸化作用对PPV的有效感染至关重要[14]。研究表明，泛素化以及细胞质中蛋白酶体的相互作用是PPV有效
感染必不可少的步骤，病毒颗粒向细胞核运动时涉及微管和肌动蛋白网络。微管在感染前8～10 h至关重要，这表明微管在PPV向核周区的内质转运中起重要作用。在感染后期(12～16 h)肌动蛋白活性对增殖性感染是必需的，它可能对传入病毒的转运以及对新合成蛋白质的核转运都是必需的[14]。
核定位序列(Nuclear localization signals,NLS)对蛋白质能被顺利转运进细胞核至关重要。腺相关病毒的衣壳蛋白具有4个潜在的NLS，分别为以下4个基本区域(Basic region,BR)：BR1、BR2、BR3和BR4。类似于小鼠微小病毒(Minute virus of mice，MVM)，PPV的VP1u含有5个潜在的NLS，即BR1
(3PPAKRAR9)、BR2 (86RAKR89)、BR3 (110RRSPRK115)、BR4 (124KR125)
和BR5 (133KKKAK137)[15]。其中BR1是1个经典的含有7个氨基酸的NLS，
而BR4和BR5是典型的二元核定位信号(Bipartite NLSs,B-NLSs)，这2种NLSs
都是病毒复制的必要条件[16]，它们的突变不影响病毒的装配，但可影响病毒增殖，表明它们在感染早期负责病毒的核转运。另外，在PPV衣壳中还可能存在3个非
线性核定位基序(Nuclear localization motif,NLM)，包装好的PPV衣壳表面的外
部区域(包含R374、R393和R565)、PPV VP2三聚体内部区域的中心区域(包含K475、R477)及病毒衣壳内表面的内部区域(包含K272、K275、K487、R533、K535、R576) [15-16]。在所有原细小病毒中，VP1 NLS和VP2 NLM在病毒装配过程中被内化到细胞核中，且不可接近转运蛋白。研究证明，MVM是主动从核中运输出来的[17]。据推测在原细小病毒粒子上，NLM或NLS的存在会干扰这种传输。然而，对PPV而言，目前并没有任何证据表明组装好的PPV病毒离子可以向细胞膜的任何囊泡转运[2]。
目前，已知的大多数影响PPV生物学特性的突变都是在衣壳蛋白上发现的，唯一例外的是NADL-2毒株NS1蛋白的I481L突变，该突变位点与VP2的N348H 突变一起作用有助于NADL-2毒株在犬细胞系A72中产生细胞病变效应并以高滴度复制。NADL-2毒株和Kresse毒株的基因组在右端尾部发夹结构附近有13个核苷酸(Nucleotides,nt)和127 nt的重复序列。这2种病毒的结构蛋白之间只有6个氨基酸差异，其中5个氨基酸差异(I215T、D378G、H383Q、S436P和
R565K)也存在于其他毒力毒株中。定位于衣壳表面的3个氨基酸差异(D378G、H383Q和S436P)使NADL-2毒株不能在原代牛睾丸细胞(TV)中复制，并将滴度和细胞病变效应降低到与猪源细胞系(PT和PFT)中Kresse毒株相当的水平[18]，后来发现，S436P在体外不参与组织向性[3]。由于在毒力毒株(27a毒株)和无毒力毒株(143a毒株)的436位氨基酸均为苏氨酸(Thr)，进一步从侧面证实VP2的D378G和H383Q的氨基酸突变可能改变PPV的致病性[7]。
PPV感染后3 h可促进PK-15细胞中p53的积累，p53通过线粒体介导的凋亡途径激活Caspase-9和Caspase-3，从而使线粒体释放细胞色素C[19]。在PPV YL 株感染60 h后的猪睾丸细胞(ST)和PK-15细胞中，凋亡细胞的比例可达50%，而在PPV Kresse毒株感染的PT细胞中，凋亡细胞的数量仍低于14%[2,20]。Kresse毒株感染期间PT细胞死亡的主要形式包括感染核肿胀、早期细胞膜衰竭
(如碘化丙啶摄取)、乳酸脱氢酶快速释放和病毒DNA自由释放，这些形式最终均
指向坏死[20]。即使PPV衣壳的微小突变也能改变其与宿主间的相互作用，并改
变病毒的细胞病变效应[2,21]。PPV感染所引发的病变效应在很大程度上取决于毒株类型和细胞类型。然而，细胞早期解体加速了PPV的体外释放和扩散，这些过
程对体内病毒的生命周期有非常显著的影响。在PPV中已经进化出一种可以促进
细胞快速溶解和病毒释放的小的选择性翻译蛋白(Small alternatively translated protein,SATp)，该蛋白与VP2共用1套mRNA，其起始密码子是VP2起始密码子下游的7个核苷酸。SATp是一种内质网(ER)驻留的短膜蛋白(68AA)，包含1
个跨膜螺旋，可加速细胞死亡和病毒传播[2]。无论是否存在SATp，在受感染的PT细胞中，PPV感染都会诱导未折叠蛋白反应(Unfolded protein
response,UPR)。在感染后12～14 h，它还导致抗凋亡的内质网应激蛋白X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)可逆地激活。在感染后期，SATp的存
在通过使ER应激不可逆加速细胞凋亡。
4 PPV的遗传变异与进化
一直以来，研究者认为PPV的基因组比其他细小病毒更保守[5]。然而，最近研究者发现,PPV的基因组并不是原以为的那么保守，通过系统研究野外分离株中VP
蛋白的遗传多样性，PPV至少分为7个簇(Cluster)，其中C和D簇中欧洲毒株占优势，而F簇中中国毒株占优势，未观察到野猪分离株的分簇与地理分布的相似
关系[4]。在同一地区，从野猪种群中检测到的PPV较家猪群中的PPV多样性更
丰富。相关研究表明，传统的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和D簇中一些新的强毒株[22]。据推测，这些突变体可能是逃避疫苗接种所带来的免疫压力而产生的。然而，根据现有的序列分析发现，在组织培养或接种牛群中存在抗体时，观察到的PPV遗传多样性降低，而在疫苗株衣壳上发现的一些突变位点(NADL-2毒株
I320S、H383Q及Str.Challenge毒株S45T、P436S)也没有出现在新的PPV突
变体上[23]。因此，可以认为疫苗接种失败和未接种动物(如野猪)种群对新出现的
表型产生的影响可能比接种种群更重要。
PPV分离株的系统发育与毒力之间没有显著的相关性。病毒毒力强弱可能直接或
间接影响如组织特异性和长期/高滴度脱落等生物学特征，这也决定了PPV毒株在高度可变的田间条件下的适宜性。对田间毒株的NS和VP基因突变模式的研究表明，这2个编码区的进化有明显差异，VP基因的突变率是其中1个NS基因(10-5)的30～50倍(约3～5×10-4突变/核苷酸·年)[2]。这与在NS区域发现的非同义和同义取代率之间的负差异一起表明，允许NS蛋白质维持功能的核苷酸变化数量是有限的，同时纯化选择(Purifying selection)即负选择(Negative selection)决
定了该区域的进化。相反，早期的研究表明，VP1/VP2基因是在近中性模式(漂移)下进化的[2]，但在决定细胞相互作用和免疫原性的衣壳外环上的几个位置被正选
择(Positive selection)[24]。此外，大多数突变发生在表面环，其中215、228、383、414、419、436位氨基酸似乎是衣壳中的主要可变位点[2,24]。普遍认为，小DNA病毒中CpG缺失的主要原因是来自复制优势和/或免疫逃逸的自然选择。PPV基因组是CpG缺失的，CpG位点比PPV基因组中的GC或C和G位点更容易发生突变。因此，突变压力而不是选择力，是导致PPV基因组中CpG表达不足的原因[2]。
5 PPV的检测与预防
PPV常用的检测方法有分子生物学检测方法、血清学检测方法等，其中分子生物
学检测方法主要包括常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR[25]、环介导等温
扩增技术(LAMP)、聚合酶重组酶扩增技术(RPA)[26]以及基因芯片检测技术等[2]。由于PPV能凝集鸡、豚鼠、小鼠、人、猴、鼠和猫的红细胞，因此，血凝(Hemagglutination assays，HA)和血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition assays，HI)仍然是一种有效的PPV血清学检测方法，在研究和实践中
广泛使用。而酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用的检测PPV特异性抗体的方法；血清学方法还包括病毒中和试验、改良的直接补体结合(Modified direct complement-fixation，MCDF)试验等。另外，还有基于NS1蛋白的区分感染动物和接种动物的重组DIVA(Differentiating infected from vaccinated animals)试验等[2]。一旦感染PPV则很难清除，所以控制PPV流行的主要措施是接种疫苗。目前，使用较广泛的疫苗是PPV灭活苗和弱毒苗，另外PPV病毒样颗粒(VLPs)疫苗的研究也很多，PPV疫苗的应用在很大程度上控制了PPV的流行和传播[27]。但由于PPV新的强毒株的出现及经典疫苗防治失败的案例的出现对PPV 疫苗提出来新的挑战。
6 小结
随着生物学技术的飞速发展，PPV的分子生物学相关研究已取得了很大进展，在PPV的检测与预防方面也取得了进展，PPV疫苗的使用在很大程度上控制了PPV 的流行和传播。但是，依然会有因免疫失败引发的PPV疫情报道。一直以来，人们认为该病毒的遗传变异性很低，然而，随后的研究揭示了该病毒的多样性比先前预期的要大得多，PPV的核苷酸替换率大约为每年每个位点对NS1基因进行10-5次替换，每年每个位点对VP1和VP2基因进行10-4次替换，这些比率与RNA 病毒中的核苷酸替代率相似[2,3,28]。因此，随着时间的推移，常有新的PPV毒株出现，对养猪业造成潜在的威胁。在过去的几年里，也有许多新的PPV毒株被报道，但是关于这些病毒在发生和流行的信息及其更深入的研究却很缺乏。适时追踪PPV研究前沿，密切监测新毒株的出现，并对这些新毒株与经典流行毒株的致病性等特征进行深入研究，对于新型广谱疫苗的研制及有效防控PPV新毒株的流行具有重要意义。
参考文献:
【相关文献】
[1] GAVA D,SOUZA C K,MORES T J,et al.Dynamics of vanishing of maternally derived antibodies of Ungulate protoparvovirus 1 suggests an optimal age for gilts vaccination[J].Trop Anim Health Prod,2017,49(5):1085-1088.
[2] MESZAROS I,OLASZ F,CSAGOLA A,et al.Biology of porcine parvovirus(Ungulate parvovirus 1)[J].Viruses,2017,12:393-406.
[3] OH W T,KIM R Y,NGUYEN V G,et al.Perspectives on the evolution of porcine parvovirus[J].Viruses,2017,12:196-208.
[4] STRECK A F,CANAL C W,TRUYEN U.Molecular epidemiology and evolution of porcine parvoviruses[J].Infect Genet Evol,2015,36:300-306.
[5] SIMPSON A A,HEBERT B,SULLIVAN G M,et al.The structure of porcine parvovirus:Comparison with related viruses[J].J Mol Biol,2002,315(5):1189-1198.
[6] PINHEIRO DE OLIVEIRA T F,FONSECA JUNIOR A A,CAMARGOS M F,et al.Porcine parvovirus as a contaminant in cell cultures and laboratory
supplies[J].Biologicals,2016,44(2):53-59.
[7] ZEEUW E J,LEINECKER N,HERWIG V,et al.Study of the virulence and cross-neutralization capability of recent porcine parvovirus field isolates and vaccine viruses in experimentally infected pregnant gilts[J].J Gen Virol,2007,88(2):420-427.
[8] JOO H S,DONALDSON-WOOD C R,JOHNSON R H.Observations on the pathogenesis of porcine parvovirus infection[J].Arch Virol,1976,51(1/2):123-129.
[9] WILHELM S,ZEEUW E J,SELBITZ H J,et al.Tissue distribution of two field isolates and two vaccine strains of porcine parvovirus in foetal organs after experimental infection of pregnant sows as determined by real-time PCR[J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,2005,52(7/8):323-326.
[10] MENGELING W L,LAGER K M,VORWALD A C.The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance[J].Anim Reprod Sci,2000,60:199-210.
[11] MENGELING W L,PEJSAK Z,PAUL P S.Biological assay of attenuated strain NADL-2 and virulent strain NADL-8 of porcine parvovirus[J].Am J Vet Res,1984,45(11):2403-2407.
[12] ORAVEERAKUL K,CHOI C S,MOLITOR T W.Tissue tropisms of porcine parvovirus in swine[J].Arch Virol,1993,130(3/4):377-389.
[13] MIAO L F,ZHANG C F,CHEN C M,et al.Real-time PCR to detect and analyze virulent PPV loads in artificially challenged sows and their fetuses[J].Vet
Microbiol,2009,138(1/2):145-149.
[14] BOISVERT M,FERNANDES S,TIJSSEN P.Multiple pathways involved in porcine parvovirus cellular entry and trafficking toward the nucleus[J].J Virol,2010,84(15):7782-7792.
[15] LIU P,CHEN S,WANG M,et al.The role of nuclear localization signal in parvovirus life cycle[J].Virol J,2017,14:80-85.
[16] BOISVERT M,BOUCHARD-LEVESQUE V,FERNANDES S,et al.Classic nuclear localization signals and a novel nuclear localization motif are required for nuclear transport of porcine parvovirus capsid proteins[J].J Virol 2014,88(20):11748-11759.
[17] BAR S,DAEFFLER L,ROMMELAERE J,et al.Vesicular egress of non-enveloped lytic parvoviruses depends on gelsolin functioning[J].PLoS Pathog,2008,4(8):e1000126. [18] BERGERON J,HEBERT B,TIJSSEN P.Genome organization of the Kresse strain of porcine parvovirus:Identification of the allotropic determinant and comparison with those of NADL-2 and field isolates[J].J Virol,1996,70(4):2508-2515.
[19] ZHANG H,HUANG Y,DU Q,et al.Porcine parvovirus infection induces apoptosis in PK-15 cells through activation of p53 and mitochondria-mediated pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,456(2):649-655.
[20] ZHAO X,XIANG H,BAI X,et al.Porcine parvovirus infection activates mitochondria-mediated apoptotic signaling pathway by inducing ROS accumulation[J].Virol
J,2016,13:26-34.
[21] FERNANDES S,BOISVERT M,SZELEI J,et al.Differential replication of two porcine parvovirus strains in bovine cell lines ensues from initial DNA processing and NS1 expression[J].J Gen Virol,2014,95(4):910-921.
[22] JOZWIK A,MANTEUFEL J,SELBITZ H J,et al.Vaccination against porcine parvovirus protects against disease,but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain[J].J Gen Virol,2009,90(10):2437-2441.
[23] STRECK A F,HOMEIER T,FOERSTER T,et al.Population dynamics and in vitro antibody pressure of porcine parvovirus indicate a decrease in variability[J].J Gen
Virol,2013,94(9):2050-2055.
[24] REN X,TAO Y,CUI J,et al.Phylogeny and evolution of porcine parvovirus[J].Virus Res,2013,178(2):392-397.
[25] NOVOSEL D,CADAR D,TUBOLY T,et al.Investigating porcine parvoviruses genogroup 2 infection using in situ polymerase chain reaction[J].BMC Vet Res,2018,14(1):163-170. [26] 刘立兵,王建昌,经美,等.猪细小病毒重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立[J].中国畜牧兽
医,2017,44(11):215-221.
[27] 刘运超,陈玉梅,姬鹏超,等.猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展[J].河南农业科
学,2015,44(10):12-16.
[28] STRECK A F,BONATTO S L,HOMEIER T,et al.High rate of viral evolution in the capsid protein of porcine parvovirus[J].J Gen Virol,2011,92(11):2628-2636.
猪细小病毒检测方法的研究进展时间
猪细小病毒检测方法的研究进展时间 作者:赵玮，杨俊 猪细小病毒( PPV)是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染 猪细小病毒( PPV)是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染病。临床主要表现为胎儿感染死亡，产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等症状．还可致皮炎和腹泻。PPV与2型圆环病毒(Porcine circovirus type2，PCV2)协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症(Porcine postweaing mulisystemic wastingsyndrome，PMWS)的主要原因之一。近年来，随着我国规模化养猪业的发展和品种的引进．PPV感染呈扩大上升的趋势．给养猪业带来了巨大的经济损失。经初步调查，我国猪群中PPV血清阳性率高达92％左右。因此．为了保障我国养猪业的健康发展．加强对本病的检测具有十分重大的实际意义。目前，国内外已建立许多检测猪细小病毒的方法，主要有血凝和血凝抑制试验、荧光抗体技术、放射免疫测定、免疫微球试验、酶联免疫吸附试验、银加强胶体金技术、单克隆抗体技术、核酸探针检测技术以及多聚酶链式反应等。本文就该病检测方法的研究进展做一综述。 一般情况下，如果一个猪场在同一时间内仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，其他猪无明显症状，同时有证据证明是一种传染病时，应该怀疑是PPV感染，并做进一步检测。 1、病毒学检查 1．1病毒的分离与鉴定 1．1．1病料的采集和分离 70 日龄以内流产胎儿、死胎、木乃伊胎及弱仔的脑、肾、睾丸、肠系膜淋巴结或母猪的胎盘和阴道分泌物均可作为分离病毒的材料．以肠系膜淋巴结和肝脏分离率最高。病料加双抗处理，研磨至乳状，4℃冰箱过夜，3000r／min离心l0min，取上清液-20℃保存备用。准备猪肾原代或继代细胞，待细胞生长铺满至细胞瓶的1／3时，倾倒瓶内营养液．加入己处理好的病料上清lmL，37℃吸附1小时，期间每隔15min摇一次，加入无血清的维持液，继续培养3～6天，每天观察，直至细胞出现病变。未出现病变者，盲传3代．仍没有病变弃之。若有PPV存在，培养16~36小时的细胞核内可观察到包涵体．3-6天出现特征性细胞病变。病毒分离成功的关键在于是否同步接种，这是因为病毒主要在有丝分裂的S期细胞内复制，即同步接种后l6～48小时。也有人强调在种植细胞的4小时内必须将含病毒的样品加入到培养瓶中，否则病毒增殖不理想。 1．1．2病毒鉴定 ①电镜观察 将出现明显病变的细胞经胰酶消化后，经离心、洗涤处理，包埋成小块用锇酸固定，经脱水、浸透及醋酸铀和柠檬酸铅正性染色后电镜检查。在细胞核内可见大量的病毒粒子，呈圆形，无囊膜，大小约20nm。
猪细小病毒的鉴定
文献综述http://442325516＠https://www.wendangku.net/doc/e019008501.html, shmilydgjad＠https://www.wendangku.net/doc/e019008501.html, 猪细小病毒的鉴定 杜桂娇 西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌 402460 摘要：细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus）。首先发现猪细小病毒（PPV）是Mayr和Mahnel(1966)进行猪瘟病毒组织培养时发现的，认为是细胞内潜伏感染的病毒，并相继从一些正常的猪肾细胞中发现直径为22nm一23nm的病毒粒子，经核酸鉴定为DNA【2】。PPV感染可引起猪的繁殖障碍性疾病【5.8】，其特征为感染母猪，特别是初产母猪产出死胎、畸形胎、流产及病弱仔猪。母猪本身无明显症状。 关键词：猪细小病毒；诊断方法；预防与治疗；研究进展 猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）所引起的一种病毒性传染病。PPV主要集中在淋巴组织，在肺泡巨噬细胞和淋巴细胞内大量复制，损害巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞的母细胞化能力，从而引起机体免疫力下降。Hallauer等（1960～1971）从43株人传代细胞系中分离出38株细小病毒，其中大部分与PPV有共同抗原关系[l]。 Cartwright和Huek(1967)【2】从猪流产的胎儿中分离出PPV，首次证明了它的致病作用，通过血清学鉴定证实，所有上述分离毒株，包括从一些传代细胞系中分离的类似病毒均与PPV同属一型。本病于1967年在英国报道，其后欧美、亚洲及大洋洲很多国家均有本病的报道。我国也报道有本病的发生，上海、北京和江苏等地也相继分离到猪细小病毒。 1、细小病毒概述 1.1病原学细小病毒（PPV）是细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus）的一个成员。PPV呈圆形或六角形，无囊膜，直径为20nm，基因组为单股线状DNA。存在方式为完全病毒粒子和空壳病毒粒子，在氛化艳中的浮密度为1.30g/ml～1.39g/ml【3】，沉淀系数为105S。本病毒只有一个血清型，且与其他病毒不早现交叉反应，能使培养细胞产生病理变化(cytopathic effect CPE)【4.5】。 PPV对热具有强大的抵抗力。Cartwright等(1967)报道【2】：PPV在56℃ 30min
简述猪细小病毒检测方法的研究情况
简述猪细小病毒检测方法的研究情况 猪细小病毒是一种来自疱疹病毒家族的病毒，它可以引起猪的呼吸道疾病和生殖系统疾病。这种病毒对猪的生长和生产性能产生了负面影响，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。猪细小病毒的检测方法对于疾病的控制和预防至关重要。 在过去的几十年里，猪细小病毒的检测方法得到了长足的发展。早期的检测方法主要是依靠临床症状和病理学检查，这种方法的准确性和灵敏度都比较有限。随着生物技术的进步，现代的猪细小病毒检测方法变得更加快速、准确和可靠。本文将对目前常用的猪细小病毒检测方法进行简要介绍，并对各种方法的优缺点进行分析。 一、传统的病原学检测方法 1.1 病理学检查 病理学检查是一种直接观察病变组织的方法，通过镜下观察来确定病变类型和程度。对于猪细小病毒感染的猪只，病理学检查可以发现呼吸道和生殖系统等部位的病变，但这种方法缺乏特异性和灵敏度，往往不能准确地确定感染的病原体。 1.2 病毒分离和培养 病毒分离和培养是一种通过将样本接种到合适的细胞系或实验动物中，然后观察细胞病变或动物病症来确认病毒感染的方法。这种方法可以获得活病毒，便于进行进一步的鉴定和研究，但需要较长的时间和较高的操作技能，且不适用于大规模的检测。 1.3 血清学检测 血清学检测是通过检测病毒抗体或抗原来确定感染情况的方法。目前常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验（CFT）和中和试验等。这些方法能够快速、简便地检测到猪细小病毒的感染情况，但无法区分活病毒感染和病毒携带状态。 以上传统的病原学检测方法在猪细小病毒检测中均存在一定的局限性，无法满足疾病监测和控制的需求。近年来，研究人员不断地探索和开发新的检测方法，以提高猪细小病毒检测的准确性和灵敏度。 二、分子生物学检测方法 近年来，随着PCR技术和核酸序列分析技术的发展，分子生物学检测方法在猪细小病毒检测中得到了广泛的应用。PCR技术可以快速扩增病毒的核酸序列，然后通过电泳或荧光探针等方法来检测扩增产物，具有高度特异性和灵敏度，成为目前猪细小病毒检测的金标准。
猪细小病毒病的诊断与科学防控
猪细小病毒病的诊断与科学防控 摘要：猪细小病毒病是由猪细小病毒（porcinepar原vovirus，PPV）引起的一种母猪繁殖障碍传染病，该病毒可导致妊娠前期胎儿发育受到影响。健康母猪可通过接触污染的饲料、饮水等感染该病，该病一年四季均可发生，无明显的季节性特点。20世纪60年代，猪细小病毒首次从死胎中被分离，且被证明具有较强的致病性，该病在许多国家广泛流行，主要临床表现为母猪出现流产、死胎、畸形胎、分娩周期延长等症状。猪细小病毒严重影响仔猪生长及母猪繁殖，对我国生猪养殖业产生巨大的负面影响。目前，猪细小病毒易与猪乙肝病毒混合感染，从而造成疾病诊治难度增加，给我国临床疾病预防带来极大困难。 关键词：猪；细小病毒病；诊断；治疗；预防措施 引言 随着更加敏感和具有更多选择性的新型分子生物学技术应用于猪病原检测，对养猪业具有重要经济意义的病毒性疾病的流行病学研究也得到进一步的开展，而越来越多病毒以及经典病毒的检测数据也不断增加。猪细小病毒，是引起猪繁殖障碍的重要传染性病原。直到最近仍认为该病毒的遗传变异性较低，可通过疫苗接种可达到防止该病毒造成的猪繁殖障碍。但随着对该病毒的持续研究，人们对疫苗防治新兴的猪细小病毒毒株的有效性产生了怀疑。随后的研究更是从根本上改变了对猪小病毒的进化及免疫学的看法，而疫苗对新出现毒株的有效中和能力较低。这些发现对猪细小病毒的感染过程有了较为重大的进展。本文对猪细小病毒病流行病学、临床症状、发病机理进行综述，旨在为猪细小病毒感染引起的猪繁殖障碍病的预防和控制提供参考。 1发病机理 怀孕母猪被猪细小病毒侵入后表现出败血症状，并造成发育功能障碍，病毒经过胎盘血液循环侵害胎儿，致使分娩的仔猪出现弱仔、死胎、木乃伊等现象，但怀孕母猪不会表现出明显的临床症状。如果母猪在怀孕一个月内感染猪细小病
猪细小病毒生物学研究进展
猪细小病毒生物学研究进展 陈玉梅; 马丽萍; 周景明 【期刊名称】《《河南农业科学》》 【年(卷),期】2019(048)011 【总页数】6页(P1-6) 【关键词】猪细小病毒; 生物学特性; 发病机制; 遗传变异 【作者】陈玉梅; 马丽萍; 周景明 【作者单位】郑州大学生命科学学院河南郑州450001 【正文语种】中文 【中图分类】S852.65 猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)属细小病毒科(Parvoviridae)、原细小病毒 属(Protoparvovirus)中的有蹄类原细小病毒1(Ungulate parvovirus 1， UPV1)[1]。PPV最早于20世纪60年代末被确认为细小病毒科成员，是SMEDI 综合征(Stillbirths,mummification,embryonic death and infertility，SMEDI)即猪死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕的病原体[2]，对养猪业危害极大。一直以来，人们认为PPV的遗传变异性很低，通过接种疫苗可以很好地控制该病毒的传播。 然而，随着不能被经典PPV疫苗的抗血清有效中和的强毒株的出现，人们逐渐意 识到该病毒的多样性比先前预期的要大得多。因此，追踪PPV研究的最新成果， 全面更新对PPV生物学的理解，对于制定PPV的有效防控策略具有重要意义。
1 PPV的分子生物学特性 PPV是一种小的、无包膜的单链DNA病毒，基因组长4～6.3 kb[3]。病毒的2个末端序列形成大约120～200个碱基的复杂回文发夹结构(呈类似的“Y”或“T”形)[4]。PPV的紧凑型基因组只包含2个启动子，共编码7种蛋白质，并利用选择性剪接技术来扩展基因组的编码能力。2种非结构蛋白NS1和NS2是从p4启动 子转录而来，这些蛋白质对病毒复制特别是DNA复制很重要[4]；另外，还可能 含有1种假定的非结构蛋白NS3。PPV的2种结构蛋白(VP1和VP2)从p40启动子转录。二者是从一组嵌套的编码序列中翻译出来的，它们的氨基末端不同，较小的VP2是从与较大的VP1相同的RNA模板中剪接产生的。VP1有729个氨基酸残基，其中氨基末端前120个氨基酸是VP1特有的(VP1 unique region，VP1u)。而PPV的第3种结构蛋白VP3是VP2的翻译后修饰产物。此外，晚期非结构蛋 白(SAT)是由与VP2相同的mRNA启动VP2起始密码子下游的7个核苷酸表达而来的。PPV的外壳是由60个VP1或VP2结构蛋白分子组成的球形结构，呈二十面体对称排列。每个衣壳亚单位由8条反平行β链及1个α螺旋和4个环组成(图1)[4-5]。VP1蛋白大约占病毒粒子的10%，主要在病毒复制和感染细胞时发挥作用，VP2蛋白是PPV的主要结构蛋白，占病毒粒子的60%以上，也是病毒的主要免疫原性蛋白。VP1、VP2基因对于PPV的系统发育至关重要[6]。 图1 PPV VP2蛋白3D模型(A)及病毒衣壳结构(B)Fig.1 3D model of PPV VP2 with the cartoon technique(A) and the structure of PPV capsids(B) 2 PPV发病机制 PPV毒株毒力是由其可能引起的繁殖失败的严重程度来定义的[7]。大多数情况下，未怀孕成年猪或仔猪单纯感染PPV不会出现临床症状，而胎儿感染的结果随母猪 妊娠的进展而变化，流行病学研究表明，母猪妊娠前半期PPV感染可导致生殖衰竭，PPV经口服途径初次感染母猪后23～32 d穿过胎盘，经肌肉注射途径感染时
猪细小病毒疫苗及免疫程序应用
猪细小病毒疫苗及免疫程序应用 猪细小病毒（porcineparvovirus,PPV）为DNA病毒，可以引起猪的繁殖障碍性疾病。该病的主要特征为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等，尤其以产木乃伊胎为主，而母猪本身并不表现除流产之外的临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。猪细小病毒病猪细小病毒（porcineparvovirus,PPV）为DNA病毒，可以引起猪的繁殖障碍性疾病。该病的主要特征为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等，尤其以产木乃伊胎为主，而母猪本身并不表现除流产之外的临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。血清反应阴性的母猪主要在妊娠的前半期经口鼻感染病毒，结果免疫机能不全的胎儿经胎盘受到感染，从而导致疾病。猪细小病毒在世界各地普遍存在，在已报道的猪群中呈地方流行性，该病毒还可以和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)及猪伪狂犬病毒(PRV)等许多病毒发生混合感染；同时还可以与附红细胞体原虫、沙门氏菌和大肠杆菌等某些细菌、寄生虫发生混合感染，混合感染导致疾病更加难以控制，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前，疫苗免疫是控制猪细小病毒病的主要手段。 1猪细小病毒疫苗的分类 猪细小病毒的防治主要以免疫预防为主。由于PPV血清型单一及
其高免疫原性，使得疫苗接种成为控制PPV感染的一种行之有效的方法。目前用于防治猪细小病毒的疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗，这两种疫苗使用为广泛，在世界范围内取得了较好的效果。随着分子生物学技术的发展，猪细小病毒的新型疫苗正在研究与开发之中。包括基因工程亚单位疫苗、基因工程活病毒载体疫苗、基因疫苗等。 1.1灭活疫苗 灭活疫苗又称死苗，是将病原体经理化方法灭活后，但仍保持其免疫原性而制成的疫苗。灭活疫苗具有安全性好，诱导产生抗体时间长，不需要低温保存等优点。但是灭活疫苗产生抗体慢，不能诱导细胞免疫反应，抗体水平相对活疫苗较低，需重复接种，使用剂量大，费用较高。PPV灭活疫苗的研究、开发与应用已经历了30余年，目 前仍是预防猪细小病毒感染的主要手段。免疫佐剂是影响PPV灭活疫苗的重要因素，Moliter等比较了14种不同佐剂用于PPV灭活疫苗的效果，结果发现50%氢氧化铝，顺丁烯乙酰（EMA）、油水乳剂及DDA 作佐剂的疫苗，均诱导猪产生了高滴度的抗体，而用油佐剂、SDS、 L-121、氢氧化铝和油乳剂混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前在PPV灭活苗的制备中，经常采用的佐剂是氢氧化铝和油水乳剂。 Mengeling等将通过细胞培养增殖的PPV和PRV，用AEI在37°C 灭活后混合，加入10%氢氧化铝制成灭活二联疫苗用于免疫预防试验，结果发现PRV-PPV灭活二联疫苗具有良好的免疫保护作用。PRV，PPV，和JEV病均是引起母猪繁殖障碍的主要疾病，研制出灭活多联疫苗可
猪细小病毒病的症状 猪细小病毒病的诊治与预防 - 养猪技术
猪细小病毒病的症状猪细小病毒病的诊治与 预防-养猪技术 猪细小病毒是一种只能在来源于猪的生长分裂旺盛的细胞上增殖，其体外复制是杀细胞性的，细胞病变表现为细胞隆起、变圆、核固缩和溶解，最后许多细胞碎片黏附在一起，使受感染的细胞单层外形不整，呈破布条状。另外，不同毒株间存在培养温度依赖性差异，从而可以解释不同分离株在猪体内的复制能力和毒力差异的现象。传染源主要来自感染细小病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒能通过胎盘垂直传播，感染母猪所产的死胎、仔猪及子宫内的排泄物中均含有很高滴度的病毒，而带毒猪所产的活猪可能带毒、排毒时间很长，甚至终生。下面就具体来了解一下：猪细小病毒病的症状猪细小病毒病的诊治与预防。1、患病症状这种病毒主要攻击成年猪的生殖器官及生长旺盛的细胞，如精子，对于胎盘中的仔猪主要攻击仔猪的肝、脏、肺，以及生殖器官，不但具有很强的致命性还有很高的感染性。患有此种病毒，对于成年猪来说没有什么明显的特征，但过了数个月之后成年猪也会发生明显的特征反应，母猪表现为不孕不育，子宫溃烂，身体不适，严重时会出现死亡。公猪表现为性欲底下，身体不适，严重将会导致死亡。对于胎盘中的仔猪，情况比较严重，出现流产，生出死猪、畸形胎、病猪或生理虚弱的仔猪，有些猪在生出不久就夭折，还有出现木乃伊的现象。只有少数猪在生出之后才能免于一死，幸运存活，绝大多数猪都难逃厄运，给养殖者带来巨大的经济损失。2、诊断猪患上细小病毒的可能性总会存在，为
了及早发现患病猪，应该经常对猪群进行抽样检查，以防病毒在猪群内传播，造成巨大损失。对猪细小病毒的诊断方法有很多，这里笔者就简单介绍几种经常用到的，主要有血清学诊断包括了血凝试验和血凝抑制试验、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、乳胶凝集试验。分子生物学诊断技术包括了PCR检测技术、核酸探针技术、单克隆抗体技术、基因芯片技术。这些技术在检测中准确率高，速度快，但是成本相对来说比较高。3、疫苗预防近年来，公认使用疫苗是预防猪细小病毒病，提高母猪抗病力和繁殖率的有效方法。目前已有10多个国家研制出了细小病毒(PPV)疫苗，疫苗包括活疫苗与灭活苗。活疫苗产生的抗体滴度高，而且维持时间较长，而灭活苗的免疫期比较短，一般只有半年。疫苗注射可选在配种前几周进行，以使妊娠母猪于易感期保持坚强的免疫力。为防止母源抗体的干扰可采用2次注射法或通过测定HI滴度以确定免疫时间，抗体滴度大于1：20时，不宜注射，抗体效价高于1: 80时，即可抵抗PPV的感染。在生产上为了给母猪提供坚强的免疫力，最好猪每次配种前都进行免疫，可以通过用灭活油乳剂苗2次注射，以避开体内已存在的被动免疫力的干扰。将猪在断奶时从污染群移到没有PPV污染地方进行隔离饲养，也有助于本病的净化。要严格引种检疫，做好隔离。此外，疫苗的品种还有弱毒苗、基因工程亚单位疫苗及活病毒载体疫苗、核酸疫苗针对不同的情况均有不同的功效。运用疫苗是一个前沿科学却也是一个低成本高效的技术，在猪细小病毒的预防中占有主导地位。4、综合防治PPV对外界环境的抵抗力很强，要使一个无感染的猪场保持下去，
猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展
猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展 汪洋;李玲;李真;李峰 【摘要】猪博卡病毒是2009年新发现的一种猪细小病毒,近几年来在我国感染率日益升高,且常常与其他病原混合感染,增加了疫病防控的难度.论文就猪博卡病毒病原学与检测方法做一综述,为提高我国猪博卡病毒的综合防控能力提供参 考.%Porcine bocavirus is a swine parvovirus recently discovered.In recent years the infection rate was increasing in China,and often mixed infection with other pathogens,thus increasing the difficulty of disease prevention and control.This paper makes a review on the etiology and detection methods of porcine bocavirus,in order to provide reference for improving the comprehensive prevention and control of porcine bocavirus in China.【期刊名称】《动物医学进展》 【年(卷),期】2017(038)004 【总页数】4页(P98-101) 【关键词】猪博卡病毒;病原学;检测方法 【作者】汪洋;李玲;李真;李峰 【作者单位】山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600
猪细小病毒病的临床症状 猪细小病毒病的防控措施 - 养猪技术
猪细小病毒病是一种传染病，是由于感染猪细小病毒而导致，主要特征是导致繁殖障碍。是由猪细小病毒引起的一种猪的繁殖障碍病。该病具有很高的发病率和感染率，并能够通过污染的饮水、饲料等进行传播。该病的发生没有明显的季节性，通常在夏、春、秋季节都比较容易浮现发病。我国不同地区的猪群中都广泛存在该病，对养猪业造成严重影响。下面我们就一起来看看猪细小病毒病的临床症状猪细小病毒病的防控措施。 1、流行病学病原。猪细小病毒是引起该病的病原，病毒粒子外观呈圆形或者六角形，衣壳由 32 个壳粒构成，核心存在单股负链 DNA，大约在整个病毒粒子中占到 26.5%。该病毒能够在猪细胞中无限繁殖，通常原代猪肾细胞比较常见。只要细胞发生感染就会浮现病变，如裂变、固缩或者变圆等。该病毒具有非常强的反抗热及消毒药的能力，如其在56℃温度下经过 30 min 热处理依旧无法对其红细胞的凝结能力以及传染性造成明显影响，在70℃温度下也需要经过 2 h 才干够使其感染力降低，在80℃温度下加热 5 min 才干够使其死亡，且其还具有较轻的反抗氯仿和乙醚等溶剂的能力。流行特点。目前，已知猪细小病毒的惟一宿主是猪，且任何阶段的家猪和野猪都能够感染该病，其中初产母猪最容易感染。普通母猪在交配后容易感染病毒，并对胚胎以及新生仔猪造成较大的伤害。该病通常呈散发或者地方性流行。同时，由于该病毒具有较强反抗外界环境的能力，从而在被污染环境中能够长期存活，因此猪场只要发生该病，就很
难彻底清除病原，从而导致多年连续浮现发病。 2、临床症状在临床上，主要是初产母猪表现出繁殖障碍，而经产母猪、育肥猪、公猪则不会表现出症状。患病母猪在精神、食欲等方面表现正常，且能够正常发情，但部份尽管能够浮现发情但较难受孕。在妊娠中期发生感染，有些病猪会表现出腹围缩小，部份发生彻底流产或者足月后产出体型较小的仔猪；部份在产出活仔的同时还会产出不同数量的木乃伊胎；妊娠后期感染该病，部份病猪会产出畸形胎、死胎，往往导致其发生难产而造成死亡或者被淘汰。 3、鉴别诊断该病与布氏杆菌病、猪乙型脑炎、猪伪狂犬病等具有比较相似的症状，要注意进行区别。猪细小病毒病是由于感染细小病毒而导致，且主要会导致初产母猪发生繁殖障碍，使其产出畸形胎、木乃伊胎、死胎或者发生早产、晚产等；猪伪狂犬病不仅会导致母猪发生流传、产出死胎，还有导致新生仔猪、哺乳仔猪具有神经症状；猪乙型脑炎通常会导致母猪发生晚产，而公猪发病后表现出一侧睾丸发炎、发生红肿，但公猪感染细小病毒后不会表现出任何症状；布鲁氏菌病会导致母猪发生流产，并伴有关节炎，公猪睾丸发炎、发生红肿，这些都可用于区别细小病毒病。 4、防控措施应急治疗。病猪主要以抗病毒、缓解症状以及避免浮现继发感染为治疗原则。病猪可按体重每 50 kg 肌肉注射 1 mL 猪用转移因子，每天 1 次，并配合按每200 kg饲料中添加100 g 金芪毒克(黄芪多糖)，混合均匀后投喂或者任其自由采食，连续使用 3~5 天。病猪也可按体重每 50 kg 使用 2 mL 猪用排疫肽 (免疫球蛋白) 和 1 mL 猪用转移因子，混合均匀后用于肌肉注射，并配合按体重肌肉注射 0.2 mL/kg
简述猪细小病毒检测方法的研究情况
简述猪细小病毒检测方法的研究情况 随着养猪业的发展，猪细小病毒也因其高毒性和强传染性而成为猪只养殖中的一个主要问题。为了保障猪只的健康和养殖业的发展，猪细小病毒检测方法的研究已成为相关领域的研究热点。 猪细小病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种属于病毒科的DNA病毒，是一种极小的病毒，直径约为十分之一微米，很难通过常规方法进行检测。因此，目前常用的猪细小病毒检测方法主要包括传统的PCR法、实时荧光PCR法、基因芯片技术、免疫学方法和电子显微镜等。 1. PCR法 PCR法是一种广泛应用于各种病毒检测的方法，其可靠性和灵敏度在猪细小病毒检测中也得到广泛的应用。PCR方法通过扩增PCV的特定DNA区域并检测PCR产物的方法来进行检测。然而，一些PCR技术在PCV的检测中会遇到假阳性或假阴性的问题，因此需要更加精细的PCR检测技术。 实时荧光PCR法是一种最常用的PCR检测方法，它可以通过实时监测PCR产物的荧光信号而实时检测病毒的存在。此外，实时荧光PCR法还可通过特定试剂的加入进行定量检测，从而确定病毒的含量。实时荧光PCR法检测猪细小病毒的灵敏度高，可靠性强，已经成为PCV检测的主要方法。 3. 基因芯片技术 基因芯片技术是一种高通量的技术，可同时监测数百或数千个生物标记物。研究人员利用基因芯片技术研发了一种能够检测多种猪病毒的基因芯片，其中PCV也包括在内。基因芯片技术包括悬浮式和堆积式两种，悬浮式基因芯片技术研究的数据更加精细，但在操作上更加复杂，需要更高的技术水平。 4. 免疫学方法 免疫学方法通过检测病毒抗原或抗体来诊断病毒，该方法检测PCV的灵敏度和特异度都比较高。免疫体系包括直接免疫法和间接免疫法。直接免疫法适用于对血清和组织样品进行检测，而间接免疫法则适用于疫苗效果的测试。但免疫学方法不适用于检测尚未感染PCV的处硕猪。 5. 电子显微镜技术 电子显微镜技术是一种直接观察病毒、细胞和组织的方法，通过观察PCV的形态、大小等结构特征，从而进行病毒检测。但该方法受到仪器和操作技能的限制，灵敏度和特异度较低。
浅谈猪细小病毒病的流行特点及防控
浅谈猪细小病毒病的流行特点及防控 猪细小病毒病（Porcine Circovirus Disease，PCVD）是一种由猪细小病毒（Porcine Circovirus，PCV）引起的猪类传染性疾病。该病最早于1974年在德国报道，近年来在全 球范围内广泛传播，严重影响了猪类养殖业的发展。 猪细小病毒病的流行特点主要体现在以下几个方面： 广泛传播。猪细小病毒病在全球范围内广泛传播，几乎所有养猪场都存在该病的感染 情况。猪细小病毒具有强大的传染力，在猪群中迅速传播，导致高发病率和高死亡率。该 病可通过直接接触、空气飞沫、粪便和吸入病毒颗粒等途径传播。 高致病性。猪细小病毒病在猪群中的感染率极高，且易引起疾病爆发。该病通过破坏 猪的免疫系统，造成免疫抑制，使猪体抵抗力降低，容易感染其他病原微生物，导致猪类 出现多种疾病。猪细小病毒主要感染猪肝、肾、淋巴组织等器官，引起器官变性、坏死等 病变。 多样化的临床症状。猪细小病毒病具有多样化的临床症状，不同年龄、品种的猪出现 不同的病情。幼猪感染后常表现为呼吸困难、发育迟缓、食欲下降等症状；成年猪感染后 常表现为发热、肌肉萎缩、皮肤发白等症状。猪细小病毒病对猪的免疫系统具有极大的破 坏作用，使猪易感染其他病原微生物，进一步加重了疾病的症状。 高经济损失。猪细小病毒病严重影响了猪类养殖业的发展。该病在猪群中的流行会导 致高发病率和高死亡率，降低养猪场的生产效益。病猪的生长缓慢，饲料转化率低，肉质差，造成经济损失。由于该病对猪的免疫力产生抑制作用，因此还会诱发其他疾病的爆发，对养猪业的可持续发展产生严重影响。 加强疫情监测和预警。养殖场应定期开展猪细小病毒病的监测，及时发现疫情变化， 并进行准确的病原学检测，为疫情防控提供科学依据。 加强养猪场的卫生管理。养殖场应做好场地、设施和设备的清洁消毒工作，减少病毒 的传播途径。定期更换饲料和饮水设备，保持猪舍内空气的流通和通风，避免环境污染。 加强种猪的管理和筛查。对种猪进行定期的健康检查，排除携带病毒的个体，确保种 猪的健康状态，减少病毒的传播。 合理使用疫苗。疫苗是防控猪细小病毒病的重要手段，可有效提高猪的免疫力，减少 病毒的感染和传播。但使用疫苗前必须进行合理的免疫规划，选择适宜的疫苗和免疫程序，确保疫苗的有效性和安全性。
猪细小病毒NJ株ST细胞适应性研究
猪细小病毒NJ株ST细胞适应性研究 唐波; 刘国阳; 常晨; 华涛; 张道华 【期刊名称】《《安徽农业科学》》 【年(卷),期】2019(047)018 【总页数】3页(P93-94,110) 【关键词】猪细小病毒; ST细胞; 适应性 【作者】唐波; 刘国阳; 常晨; 华涛; 张道华 【作者单位】江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏南京210014; 江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014; 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014; 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 【正文语种】中文 【中图分类】S852.65+1 猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原严重危害我国养猪业[1]。该病主要引发初产母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，其他类型猪感染后则无明显的临床症状[2]。PPV的主要传染源是带毒猪，感染猪长期排毒使得其在猪群中很难清除[3]。近年来，随着规模化猪场的不断扩大，该病在我国的流行呈上升趋势[4]。目前血清学调查证实国内猪群中该病的阳性率超过90%，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[5]。目前国内控制猪细小病毒病流行
的最有效方法仍是灭活疫苗的免疫[6]。猪细小病毒疫苗生产中常用ST细胞来增殖病毒，如何获得满足生产要求且具有良好免疫原性的ST细胞适应株显得尤为重要[7]。 猪细小病毒NJ株为江苏省农业科学院动物免疫工程研究所分离及纯化获得的疫苗生产株，该毒株免疫原性良好具有疫苗候选株的潜力。笔者通过研究PPV NJ株不同代次毒种接种不同代次ST细胞，探讨病毒培养含量、血凝价及制备疫苗免疫效力随着细胞代次增加的变化，旨在为分析具有良好稳定细胞适应性的PPV NJ株是否能够满足工业化大生产要求提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 毒株和细胞 ST细胞系购自美国菌种保藏中心(ATCC)，9代、29代、59代由江苏省农业科学院传代保存；猪细小病毒毒种NJ株F8、F18代由江苏省农业科学院分离并保存。 1.2 主要试剂试验所用DMEM培养液、新生牛血清均为Gibco公司产品。 1.3 试验动物 350～400 g豚鼠(猪细小病毒HI抗体为阴性)，来源于南京青龙山实验动物中心；5～6月龄阴性后备母猪(猪细小病毒HI抗体为阴性)，购自江苏明天农牧科技公司。 1.4 病毒毒价测定将ST细胞铺于96孔培养板中，0.1 mL/孔，将不同时间段病毒液进行10倍稀释，每个稀释度分别接种10孔，0.1 mL/孔，置于37 ℃、 5%CO2培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID50。 1.5 血凝(HA)与血凝抑制(HI)抗体的检测 1.5.1 血清样品的处理。将100 μL血清56 ℃水浴中灭活30 min后，加入300 μL 25%白陶土悬液，混匀后室温下作用30 min；10 000 r/min离心10 min，吸取上清后加入100 μL 20%豚鼠红细胞，振荡、混匀后37 ℃下作用1 h；4 000
非洲猪瘟病毒的分子生物学研究
非洲猪瘟病毒的分子生物学研究 近年来，非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）已经成为全球范围 内畜牧业生产特别是猪肉生产的严重威胁。比如，2018年中国爆发的非洲猪瘟疫 情至今仍然影响着中国肉类市场的供需关系。ASFV是一种DNA病毒，是国际上 公认的对患猪种无治疗方法的病毒之一，因此ASFV的分子生物学研究一直是关 注的焦点之一。 ASFV的基本结构和基因组组成 ASFV病毒粒子呈多面体形态，直径约为200 nm，是一种典型的大型DNA病毒。ASFV基因组大小为170-190 Kbp，含有150多个编码蛋白质的基因。其中，DNA多肽酶、DNA聚合酶、酶基因、护壳蛋白基因和溶菌酶基因等都是研究重点。此外，ASFV的基因组中还包括多个与广谱宿主范围和病原性高度相关的调控因子。 ASFV的侵染机制 ASFV的侵染机制非常复杂。该病毒可以通过创口、口、鼻、直肠、消化道、 泌尿生殖系统、皮肤、羽毛、手术器械、血液、异物污染等途径进入宿主。一旦ASFV侵入宿主细胞内，病毒基因组被释放进入细胞核，重塑宿主活动状态，导致 宿主细胞酶代谢、基因转录和蛋白合成的异常。 ASFV的复制和扩散 由于ASFV基因组大小约为三倍于人类的基因组大小，因此其基因复制策略非 常复杂。ASFV基因组复制和扩散是非常缓慢而复杂的过程，因此ASFV复制生物 学研究比较困难。由于ASFV不能通过体外细胞培养，因此目前对于ASFV的复 制和扩散机制主要是通过免疫学、细胞生物学、分子生物学和生化学等多学科交叉研究手段来进行探索。 ASFV的疫苗研究
由于不存在有效的抗病毒治疗方法，疫苗研究是对抗非洲猪瘟的主要方法。提 出的新型疫苗战略，包括单独使用已知的病毒抗原、合并不同诱发免疫反应的基因，以及开发新的低病原性毒株和无病毒载体等措施。研究显示了ASFV的抗体反应 和植入响应，产生了对血清标志物和低病原性突变株的表征，为ASFV疫苗的设 计和研究提供了有力的证据基础。 ASFV的防控 由于ASFV的复制和扩散速度很慢，防疫措施可以取得显著效果。防控措施包括：1）及时发现确诊病例，执行严格的隔离和撤除措施；2）加强国际疫情监测和跨境合作；3）实施安全生产、卫生宣传和公众教育等措施。 结语 ASFV的分子生物学研究探索为ASFV的免疫预防和基于耐药原理的抗病毒药 物研究奠定了基础。然而，由于ASFV基因组极其复杂，病毒毒力强大，疫苗研 究较为复杂，目前仍需大量的研究和努力来应对非洲猪瘟病毒的威胁。
猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达
猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达 刘朝霞;刘永刚;毕可东;周顺;崔尚金 【摘要】本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名 为BQ-C.对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株 同源性为100％.为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插 入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒.经双酶切和测序鉴定,将重组质 粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分 子质量约为71.5 ku,与预期大小相符.Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性.结果表明,本研 究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断 和疫苗的研发. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2013(040)011 【总页数】4页(P50-53) 【关键词】猪细小病毒;重组VP2蛋白;原核表达;反应原性 【作者】刘朝霞;刘永刚;毕可东;周顺;崔尚金 【作者单位】青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109;中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,猪传染 病研究室,黑龙江哈尔滨150001;青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109;青
猪细小病毒6型全基因组克隆及遗传进化分析
猪细小病毒6型全基因组克隆及遗传进化分析 赵靓; 白彩霞; 王小朋; 杨侃侃; 张达; 李永东; 孙裴; 王勇 【期刊名称】《《江苏农业学报》》 【年(卷),期】2019(035)005 【总页数】7页(P1154-1160) 【关键词】猪细小病毒6型; 全基因组; 同源性分析; 遗传进化分析 【作者】赵靓; 白彩霞; 王小朋; 杨侃侃; 张达; 李永东; 孙裴; 王勇 【作者单位】安徽农业大学动物科技学院安徽合肥 230036; 宁波市疾病预防控制中心浙江宁波 315010 【正文语种】中文 【中图分类】S852.65 细小病毒是属于细小病毒科的单链非囊膜线性DNA病毒，其基因组大小为4.0～6.3 kb，由5′端UTR、非结构蛋白(NS1)、结构蛋白(Cap)和3′端UTR组成。细小病毒科宿主范围广，可根据感染宿主的不同分为感染脊椎动物的Parvovirinae亚科和感染节肢动物的Densovirinae亚科。Parvovirinae亚科由9个属组成，包括Dependoparvovirus、Copiparvovirus、Bocaparvovirus、Amdoparvovirus、Aveparvovirus、Protoparvovirus、Tetraparvovirus、Erythroparvovirus和Marinoparvovirus[1]。猪细小病毒1型(PPV1)属于Protoparvovirus属，于1965年首次从德国的细胞培养污染物中分离得到[2-3]。PPV1被认为是导致发生
猪繁殖障碍的主要原因之一[1,4]，主要表现为怀孕母猪出现流产、产死胎、畸形 胎或木乃伊胎等症状，造成了全球养猪业巨大的经济损失[4]。 在过去的二十年中，在猪的身上检测发现一些新型的猪细小病毒，分别被命名为PPV2～PPV7。PPV2是2001年在缅甸的一次戊型肝炎病毒血清调查中发现的[5]。PPV3又称PARV4或Hokovirus，与人类细小病毒4型(PARV4)密切相关，于2008年在中国香港被发现[6]。PPV4、PPV5和PPV6是近年来发现的，属于Copiparvovirus属[1]。与其他猪细小病毒相比，PPV4拥有一个额外的ORF3， 它于2010年在与PCV2共同感染的猪中被发现[7]。2013年和2014年，在中国和北美分别发现了PPV5和PPV6[8-11]。基于遗传进化分析显示，PPV4、PPV5和PPV6密切相关，形成一个明显的分支[9,11]。PPV7是2016年美国研究人员 通过对猪直肠拭子进行宏基因组测序发现的一种细小病毒[12]。然而，目前仍不清楚这些新发现的PPV基因型是否与临床症状有关。 本研究从安徽地区采集到患病猪的7份临床样品，从中检测发现有一个样本呈现PPV6阳性。本研究对其进行全基因组克隆及遗传进化分析，为后续开展PPV6相关研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 病料来源 7份有发生流产现象的死猪肝脏及肺脏样本，采集于安徽省部分地区，样本放置-80 ℃冰箱保存备用。 1.2 主要试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker 和DH5α感受态细胞均购自TIANGEN 公司，50×TAE缓冲液和GoldView I型核酸染色剂(×10 000 )购自北京索莱宝科技有限公司， pMDTM19-T Vector、Solution I购自宝日医生物技术(北京)有限
细小病毒资料
关于细小病毒的研究进展 摘要：猪细小病毒病是引起母猪繁殖障碍的主要疾病之一,由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起,主要导致母猪特别是初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪,偶有皮炎、腹泻及关节炎,母猪本身一般无明显症状。是由Mayr 和Mahhel l(1966)进行猪瘟病毒组织培养时发现的, 从培养细胞中发现并分离得到的一种小DNA病毒。本病最早于1967年报道于英国,现呈世界性分布并在大多数猪场呈地方性流行。我国于1982年由中国兽药监察所分离到该病毒,此后在上海、黑龙江、吉林、四川、浙江等地均分离到该病毒,虽然各地分离的PPV来源不同,名称各异,但均为同一型,血清学上无差别。近年来,随着养猪业的发展,大型集约化猪场的相继出现,该病的发生呈上升趋势。PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为4个类型。研究表明,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,而且能够引起多种猪病。Blot等[5]证实PPV与猪的非化脓性心肌炎有关系。 一猪细小病毒病原学研究 1.1PPV的结构特点：PPV 属于细小病毒科细小病毒属,外观呈六角形或圆形, 20 面体等轴立体对称, 无囊膜,衣壳由32个壳粒组成核心含单股线状DNA，长约5.2kb,能通过孔经为42nm的滤器。平均直径20～26 nm, 分子量为5.3×106Da, G+C为48%,该病毒粒子有2 种: 实心病毒粒子具有感染性和血凝活性; 空心粒子不具有感染性。2 种粒子在氯化铯（作用是什么）中的浮密度分别为 1.39 和 1.30 g/cm3, 是目前发现的动物病毒中一类最小最简单的单链线状DNA