酵母双杂交的一些问题

研究蛋白互作的方法

蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧

常用的体外互作研究方法：

1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)

酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。

优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。

⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。

“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。

“假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。

2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）

用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。

体内互作的研究

1、荧光共振能量转移（FRET）

荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的

荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。

由于只有在蛋白之间的距离达到10nm一下才会发生FRET，而10nm要小于蛋白互作要求的距离，所以FRET是衡量体内互作的强有力的证据。

2、双分子荧光互补(BiFC)

是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上。

由于BiFC的直观，而且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。所以，BiFC越来越受到研究人员的青睐。

酵母双杂交的相关知识

时间：2009-12-29 16:45:17 来源：作者：点击：153次

结构组成：

酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。

此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。

特点与优点：

酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、 p16与CDK4iv等之间的相互作用。

局限性和存在的问题

酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另

外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。

许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:⑴用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，可明显减少假阳性。⑵通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。

哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。

酵母双杂交基本原理

时间：2009-12-29 16:32:07 来源：作者：点击：170次

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd

具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad 氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；

另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

研究蛋白质相互作用的技术平台―酵母双杂交系统的发展和应用

时间：2010-03-08 15:40:01 来源：作者：点击：339次

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。

酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。

基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。

1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1 与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

酵母双杂交实验常见问题

时间：2010-03-08 15:55:53 来源：作者：点击：66次

1.如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？

在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA 刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

2.如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？

该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

3.转化效率太低怎么办？

可以采用以下方法解决：

1)检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。

2)DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3)不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。

4)检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x105 colonies/mg DNA以上。

4.杂交效率不高，该如何处理？

在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x109/ml。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。

酵母双杂交实验常见疑难解答

时间：2011-01-10 11:48:02 来源：作者：点击：29次

问：如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？

答：在有些情况下，在液体培养基中培养不好的菌株可以在固体培养基上生长得很好。重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板。在30℃下温浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA 刮下每块板上的克隆，并收集到一管中。接着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

问：我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？

答：该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。这可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活。但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

问：转化效率太低，怎么办？

答：1、检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。

2、DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3、不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。

4、检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。

问：杂交效率不高，该如何处理？

答：在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的，新鲜的克隆进行培养。经过离心和重悬后，使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/ml。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。

酵母选择营养缺陷培养基-酵母SD-SC/Dropout-酵母营养缺陷型筛选标记－酵

母表达质粒启动子与标记基因

默认分类2010-08-26 08:34:26 阅读44 评论5 字号：大中小订阅

一、全合成选择缺陷型培养基Yeast selective media(一缺或单缺,二缺培养基/三缺,四缺培养基/五缺培养基)

酵母缺陷培养基种类：

(1).一缺: -Trp,-Leu,-His,-Ura,-Met,-Ade

(2).二缺: -Trp-Leu, -Trp-His,-Trp-Ade,-Leu-Ade,-His-Ade,-Leu-His,-Trp-Ura,-Leu-Ura,

-His-Ura

(3).三缺: -Trp-Leu-His ,-Trp-Leu-Ade等等

(4).四缺: -Trp-Leu-His-Ade

(5).五缺: -Trp-Leu-His-Ade-Met, -Trp-Leu-His-Ade-Ura

对于上述酵母筛选标记的解释可参见博文【神奇的酵母遗传学与高等生物基因功能研究讲座三】

包装：40g/瓶

价格：500元/瓶（外地3瓶以上免运费）；北京市内：450元/瓶

泛基诺温馨提示: 上述培养基含有各种所需成分(葡萄糖除外, 因为有些研究者用其他糖类如半乳糖做诱导表达), 为各种氨基酸和酵母含氮碱/氮源的混合物干粉，按照8g/L称取, 加水后即可配制成相应的培养液, 无需再添加任何其他成分。

高压灭菌后加无菌葡萄糖至终浓度为2％(或棉子糖)或实验所需的特定诱导物(如半乳糖用于GAL1启动子的诱导表达)即可,适用于酵母蛋白质的表达，酵母单杂交(yeast one-Hybrid)和酵母双杂交(yeast two-Hybrid)系统等的选择缺陷型培养, 筛选含特定标志基因的酵母表型. 有关酵母表型与选择标记基因的理论问题可发电子邮件到进行详细咨询。

最小包装：40克/瓶

零售价：500元/40g/瓶（促销期优惠价）

批发价：协商

二、无酵母氮源的氨基酸混合物(Dropout)

一缺、二缺、三缺、四缺、五缺等

三、普通培养基

1).YPD 450元/瓶

2).YPDA 450元/瓶

3).YPD-plus 450元/瓶

四、酵母基因克隆与表达载体

(一).功能型骨架载体-----用于不同用途的功能研究和载体改造

1、酵母基因组整合质粒(Yeast integrating plasmid, YIP)

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标志(5).G418筛选标志

此类质粒经酶切线性化后可整合到酵母细胞基因组中

用途: a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合(integration)和敲入(knock in)

2、酵母中心粒-自主复制质粒(Yeast CEN-ARS plasmid, YCP)

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标志(5).G418筛选标志

此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。

用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研

究

3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标志(5).G418筛选标志

此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝

用途: 用于外源基因的表达

(二). 表达载体

1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标

2、Cup1启动子表达载体-----硫酸铜诱导的表达载体

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标志(5).G418筛选标志

3、ADH启动子表达载体-ADC1组成型表达载体

(1).Trp筛选标志(2).Ura筛选标志(3).Leu筛选标志(4).His筛选标志(5).G418筛选标志

五、酵母转化试剂及试剂盒

1) 10X无菌PEG4000-液体

2) 10X LiAc-无菌液体

3) 运载体DNA (Carrier DNA,10mg/ml )

六、酵母质粒回收试剂盒(KGN010)

简介：从酵母细胞中回收质粒是酵母遗传学重要的实验技术, 在酵母单、双、三杂交实验中更是不可或缺。很多实验者按照出版的技术资料如分子克隆和现代分子生物学操作手册等往往都回收不到质粒, 该试剂盒提供的操作程序是酵母细胞质粒回收的最佳选择, 具有高效性和重复性好等优点。

七、常用酵母细胞表型资料(仅供参考)

YPH499 MATa: ade2-101ochre his3-△200 leu-△1 lys2-801amber trp1△1-63 ura3-52-

YHP500 MATα: ade2-101ochre his3-△200 leu-△1 lys2-801amber trp1△1-63 ura3-52-

W303-1A MATa: leu2-3, -112; his3-11, -15; trp1-1; ura3-1; ade2-1; can1-100

W303-1B MATα: ade2-1 leu2-3,112 his311 his3-15 trp1-1 ura3-1)

BY4741 MATa:his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0

BY4742 MATα:his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0

JRY2726 MATa:his4

JRY2728 MATα:his4

FGN2749 蛋白酶缺陷株-----用于易降解或不稳定蛋白的高效表达与纯化

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神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究系列讲座(二)酵母双杂交系统的

前世今生

酵母遗传学方法与2010-08-02 15:39:40 阅读181 评论11 字号：大中小订阅

酵母双杂交系统的原理、应用与进展

作者: 泛基诺技术总监胡恩泛

【编辑部按：无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用】

酵母遗传学对二十世纪九十年代以来的生命科学与医学研究产生了极大地推动作用，其威力之巨大、影响之深远、应用之广泛使得其他任何一种模式生物都不能望其项背。这一节主要讲述酵母双杂交系统原理的最新诠释和实验操作精要。

酵母实验操作在国内研究型实验室广为传播的主要原因还是酵母双杂交系统的应用和发展，关于酵母双杂交系统的原理，这方面的文章俯拾皆是，但无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用。

【正文】酵母双杂交系统首先由Stanley Fields实验室建立的，其原始出处参见1987年Cell杂志上的论文。该系统的理论基础是建立在对于酵母半乳糖代谢调控的两个关键转录因子Gal80负调控因子和Gal4正调控因子的功能解析

上。

GAL4基因是酵母糖代谢中的一个重要基因，其编码的蛋白质Gal4（备注: GAL4表示基因，Gal4表示蛋白）具有两个结构域：位于N末端的DNA结合结构域(DNA-binding domain,简称BD)和位于C末端的转录激活结构域(transcription-activating domain,简称AD)。DNA结合结构域（BD）能识别GAL1基因启动子的上游激活序列（Upstream Activating sequence,UAS），转录激活结构域（AD）可同转录复合物的其他成分作用，启动GAL1基因的转录。GAL1基因上游含4个特殊序列UASg (upstream activator sequence-galactose)。每个UASg由17bp序列构成，当加入半乳糖作为诱导物后，Gal4可全方位的与GAL1的UASg结合，从而使GAL1基因的表达成千倍地增加。

Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因

(LacZ,His3,Ade2)。

1991年，我在美国做博士后期间, 老板从Stanley Fields实验室获得原始材料，让我对菌株和质粒进行改造，原始菌株是SCY90，实际上将它作为起始材料基本上没有任何用处，因为其中的标志基因已经没有选择的余地，只能从W303-1A/-1B系列或YPH499/500系列开始.。我试图从以下几个方面来改进：1）用不同的启动子序列代替单一的GAL1，并将上游激活序列用定点突变（SDM）的方法进行优化；2）用三报告基因（Ade2、His3、LacZ）替换单报告基因（LacZ）和双报告基因（LacZ，His3）。这些工作三言两语说得轻巧，可做起来却花费了我近两年的时间。要知道，我们还要将原始菌株中的编码Gal80和Gal4这两个基因敲除（注意：酵母基因敲除英文不用knock out，而是用deletion，所以中文描述应该是基因删除）。熟悉酵母分子遗传学操作的人都知道，删除酵母的某个基因时，需要在基因组中插入可供筛选的标记基因，但为了方便后续实验，即为保证最终获得的酵母报告菌株有较多的选择标记基因可用，还需要将先前插入的标记基因再删除以备后续酵母转化实验中的质粒转化选择筛选，这些工作可是非常的time consuming！另外，当时定点突变采用的方法是Uracil选择法，该法费力耗时，可不像现在所采用的Strategene的SDM法简单快捷。在我走后又过了几年，双报告基因和三报告基因就先后商业化了，如Y187和AH109等.

不久前，由于一个委托研究课题的需要，我用荧虫酶报告基因Luciferase将LacZ置换掉，原始材料分别选用Y187和AH109，在实验之前，需要对局部基因组区域测序收集有关信息，结果发现：Y187和AH109这两个酵母报告株每个报告基因的上游UASg序列与我当年用定点突变优化的组合序列竟完全一致，一个碱基也不差!！我真的不敢想这是否就是出自我当年之手。谈笑间，二十年过去，往事如梦，但一切又仿佛是在昨天，令人感慨万千! 有一首歌是怎么唱的来着？仿佛是：多年后，终点又回到了起点。这就是酵母双杂交系统的前事今生！二十年前酵母遗传学的副产品酵母双杂交系统

如今在后基因组时代-蛋白质组研究中再次大放异彩。

酵母双杂交原理、操作方法

酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的

酵母双杂交原理及步骤

酵母双杂交原理及步骤 以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。 酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。 酵母双杂交实验的步骤如下： 1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。 2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。 3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域

和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。 4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。 酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。 酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

酵母双杂交 原理

酵母双杂交原理 酵母双杂交（Y2H）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术。它基于酵母细胞内所含的转录因子结合区域分开的与激活区域结合的能力的原理而发展出来。 当把转录因子分成两个区域，一个称为DBD（DNA binding domain），另一个称为AD（activation domain），并使它们相互独立地与相应的配体结合时，它们就可以进行有效的转录激活。通常来说，DBD和AD都不具有激活作用，但它们可以相互结合并发挥起激活作用。因此，当DBD与某一DNA序列结合时，如果另一配体结合于AD，则该复合体就可以被转录激活。 基于这个原理，Y2H技术使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验系统进行实验。它使用了两个重要的质粒：一个称为“鱼钩”质粒（bait plasmid），它含有DBD和一个感兴趣的基因的DNA序列；另一个称为“猎物”质粒（prey plasmid），它含有AD和另一感兴趣的基因的DNA序列。这两个质粒分别要被转化到两个不同的酿酒酵母分别作为它们的基因组。 当两个酵母的基因组都被转化后，它们被分别引入到含有选择性培养基的平板中去。在这些平板上，只有那些同时表达了成功酯化的双杂交融合DBD和AD的细胞才能成

长起来。因此，这个实验系统几乎可以保证筛选到高亲合力的蛋白质因子。 值得注意的是，由于酿酒酵母是真核生物，与含有DBD和AD的两个质粒的匹配也是在真核生物级别上完成的，而不是简单的受体和配体之间的作用。因此，这种技术可以很好地模拟在真核生物细胞内发生的相互作用。 Y2H技术不仅可以用于蛋白质因子的筛选，也可以用于检测DNA的相互作用。例如，在要求蛋白质－DNA相互作用的特定细胞系上建立的实验系统中，可以使用这种技术来筛选那些与基因诱导子结合的转录因子。因此，该技术可用于分析人类疾病中蛋白质相互作用的发生机制。 总的来说，酵母双杂交技术是一种强大而有效的分子生物学工具，可以用于研究蛋白质之间的相互作用以及转录机制。它不仅可以被用于大规模的筛选，还可以在分子水平上模拟真核生物细胞内的相互作用。在以后的研究中，这种技术还将发挥更广泛的作用，因此我们对它的进一步研究依然很有必要。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息

酵母双杂交实验原理及具体步骤

酵母双杂交 原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。 方法：

酵母双杂交技术应用进展

酵母双杂交技术应用进展 酵母双杂交技术是一种强大的生物技术方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。这项技术自20世纪80年代问世以来，已经广泛应用于基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域。本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用进展及未来展望。 酵母双杂交技术是基于真核生物体内两个互补的转录因子，即GAL4和DBD-VP16，以及一个含有报告基因的载体穿梭质粒构建而成的。在该技术中，一个转录因子（DBD-VP16）与一个诱饵蛋白结合，另一个转录因子（GAL4）与目标蛋白结合。当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，两个转录因子将形成一个复合物，该复合物将激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况，可以确定蛋白质之间的相互作用。 基因功能研究 酵母双杂交技术已成为研究基因功能的重要工具。通过使用该技术，科学家们可以筛选出与特定基因相互作用的其他基因，从而揭示基因在细胞中的功能。例如，一项研究发现人类肺癌细胞中抑癌基因TP53的相互作用蛋白，从而为肺癌治疗提供新的思路1。

在药物研发方面，酵母双杂交技术也发挥了重要作用。通过该技术，科学家们可以筛选出能够与特定药物靶点相互作用的小分子化合物，从而发现新的药物候选。例如，利用酵母双杂交技术成功发现了一种能够抑制乳腺癌细胞增殖的新药候选2。 酵母双杂交技术在生物技术应用方面也具有广泛的应用价值。例如，利用该技术成功克隆了一个编码具有工业应用价值的酶的基因，并实现了该基因的高效表达3。酵母双杂交技术还被用于构建具有重要应用价值的基因调控网络。 随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。在基因组学领域，利用酵母双杂交技术可以揭示基因之间的相互作用和调控关系，有助于深入理解生命活动的复杂性。在蛋白质组学领域，酵母双杂交技术可以应用于蛋白质相互作用的研究，为揭示生物学过程和疾病机制提供有力支持。在代谢组学领域，酵母双杂交技术可以帮助研究代谢物之间的相互作用和调控机制，为代谢调控和代谢性疾病研究提供新的视角。 酵母双杂交技术是一种非常有用的生物技术方法，在基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域均具有广泛的应用价值。随着相关研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。未来可以进

酵母双杂的原理及应用

酵母双杂（Hybrid Yeast）的原理及应用 1. 引言 酵母是一类单细胞真菌，广泛应用于食品、药品和酿造等领域。酵母双杂（Hybrid Yeast）是利用不同类型的酵母进行交配培育出的一种新型酵母。本文将从酵母双杂的原理和应用两个方面进行介绍。 2. 酵母双杂的原理 酵母双杂是通过将两个不同的酵母菌株进行交配，融合不同的基因组合来实现的。酵母双杂的原理主要包括以下几个步骤： •菌株选择：选择两个质态互补的酵母菌株作为双杂交配的材料，通常选择具有不同性别的菌株，如雄性和雌性，以增加交配概率。 •受精：将选定的酵母菌株分别培养在含有营养物质的培养基上，培养基中的营养物质可以刺激菌株的生长和繁殖。通过培养，使酵母菌株达到一定的生长周期后，将雄性酵母菌株的细胞液与雌性酵母菌株的细胞液混合，实现受精。 •融合：经过受精后的酵母菌株会发生细胞融合，合并两个菌株的基因组，形成新的酵母双杂。 •筛选：对融合后的酵母双杂进行筛选，通过培养基中添加相应药物来筛选能够生长和繁殖的酵母双杂，去除无法存活的酵母菌株。 •稳定化：经过筛选后，将生长良好并符合要求的酵母双杂进行稳定化处理，使其具有较稳定的遗传特性。 3. 酵母双杂的应用 酵母双杂在许多领域中都有广泛的应用。以下是酵母双杂的几个应用方面：•食品工业：酵母双杂可以用于酵母发酵食品的生产，如面包、啤酒和酸奶等。通过融合不同的酵母菌株，可以增加食品的品种和口感。 •药品生产：酵母双杂在药品生产中起到重要的作用。利用酵母双杂可以合成多种药物原料，如抗生素、维生素和氨基酸等。通过优化菌株的基因组合，可以提高药品生产的效率和产量。 •酿造业：酵母双杂在酿酒过程中起到关键作用。不同的酵母菌株具有不同的发酵特性，通过酵母双杂可以培育出更适合酿酒的菌株，提高酿酒的质量和口感。

酵母双杂交技术

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酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1

酵母双杂的原理

酵母双杂的原理 酵母双杂也被称为酵母双杂交试验，是一种常见的遗传分析技术。它基于酵母细胞在特定条件下能够进行性状表达的能力，通过将两个不同的酵母株杂交，观察它们的后代表现出的特定性状，从而了解这些性状背后的遗传变化。酵母双杂的原理涉及到多个因素，下面我们将详细探讨其中的几个主要方面。 1. 酵母细胞的基本生物学特性 酵母细胞是一种单细胞真菌，相对于高等生物细胞而言，其体积和基因组相对较小，生长周期较短，生命周期较为简单和轻松。因此，酵母细胞成为了分子生物学研究中常用的模型生物之一。酵母细胞对环境变化的反应能力强，可以在不同的温度、pH值、营养物质等条件下进行生长，从而满足生命活动的需要。 2. 酵母表达系统的构建与优化 为了利用酵母细胞进行遗传分析，必须建立切实有效的表达系统来实现基因的外源表达和功能研究。酵母表达系统的优点在于其操作简单、易于维护和扩展。酵母表达系统的核心构建是将外来DNA片段嵌入酵母基因组中，通过编码之后的蛋白质在细胞内部进行活动，影响表现出来的生物学特性。通过不断地对酵母表达系统的构建与优

化，可以有效提高其操作性能，为酵母双杂交实验的开展提供了坚实的基础。 3. 酵母杂交的过程与特点 酵母双杂交的基本特征是将外源DNA片段插入到不同酵母株的染色体中，使得它们进一步控制性状表达。在杂交前，需要先将一段特定的序列嵌入到外源DNA片段中，以使其呈现可检测的表型。一旦杂交成功，杂交株会承担多种不同的表型。这些表型如何传递到后代，和直接交叉和突变等因素有关。通过对后代的不断筛选，可以获得对基因的分离，解释各种表型的利器。 4. 酵母双杂的应用 酵母双杂的应用范围非常广泛。在科学研究领域，它被用于鉴定基因与相互作用网络的建立，为基因组学、蛋白质组学等学科提供了重要工具。同时，在制药、食品安全等产业领域也有着广泛的应用，酵母双杂可以用于筛选候选药物靶点，也可以用于检测食品中的致病微生物和有害物质。 综上所述，酵母双杂交试验是一种基于酵母细胞表现出性状变化的遗传分析技术。其实现与优化需要考虑到酵母细胞的基本生物学特点和表达系统，了解酵母杂交的特点和应用场景，并不断地探索和完善其操作流程，从而为科学研究和实际应用带来更多的价值。

验证蛋白互作的方法

验证蛋白互作的方法 生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。 一、酵母双杂交（Y2H）法 酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。 首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。 虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。

二、共免疫沉淀法（Co-IP） 共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。 具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。 这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。 三、蛋白芯片（Protein Microarray） 蛋白芯片是一种基于DNA芯片技术的高通量筛选平台，可以在单次实验中同步检测大量的蛋白质相互作用。

酵母双杂交名词解释

酵母双杂交名词解释 酵母双杂交名词解释 酵母双杂交是基因学领域的研究方法之一，其主要是通过两种不同类 型的酵母菌之间的交配达到检测基因交互作用的目的。在酵母双杂交中，每个基因都被分别连接到酿酒酵母中唯一的两个分子，利用蛋白 质交互作用而使得两种酵母菌互相连接并产生可观测的效果。本文将 按类别对酵母双杂交进行详细解释。 1. 酵母：酵母是一类单细胞真菌，研究人员可以利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物进行基因研究。酵母具有许 多极其有用的特性，比如其遗传可重复性很高，因此研究人员可以利 用酵母来进行基于DNA的研究。 2. 双杂交：双杂交是指一种检测蛋白质相互作用的方法。该方法通过 在酵母的细胞内部形成蛋白质复合物，而使蛋白质相互作用的结果在 酵母细胞内可观测到，从而达到检测蛋白质交互作用的目的。在酵母 双杂交中，两种酵母菌互相连接，产生可观测的效果。研究人员可以 利用该方法来检测不同蛋白质之间的交互作用。 3. 名词解释：酵母双杂交可以被定义为一种鉴定基因交互作用的方法，该方法通过酵母细胞内的蛋白质交互作用导致的效果来检测基因交互 作用。同时，酵母双杂交也可以被定义为酿酒酵母之间的一种孢子杂 交法。

4. 操作方法：酵母双杂交技术需要利用DNA重组方法，将目标基因在拼接时连接到酵母二杂交系统（Y2H）中的激活子，而将其连接到另一种被测体系（prey）中，还需要使用质粒在酵母菌当中进行转化；随后，其菌落在关键培养基上生长出菌丝，涂上试纸液，观察菌落是否变色，判断蛋白之间的作用是否发生。 总之，酵母双杂交在基因学领域中发挥着重要的作用，在生物学的方方面面都有着广泛的应用。它是许多基因测序研究的前提，也是基因组学的核心研究方法之一。我们相信，随着科技的不断提高，这一技术将发挥更加巨大的作用，进一步推动基因学领域的发展。

酵母双杂交鉴别

酵母双杂交鉴别 酵母双杂交鉴别是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和酵母细胞中的信号转导通路。本文将介绍酵母双杂交鉴别的原理、操作步骤和应用，并探讨其优缺点及未来发展方向。 一、原理 酵母双杂交鉴别是基于酵母细胞中的转录激活子-蛋白质相互作用的原理。该技术利用酵母细胞内的转录激活子（activation domain，AD）和DNA结合域（DNA-binding domain，BD）的相互作用，实现对蛋白质相互作用的鉴定。在酵母双杂交系统中，AD和BD分别与待测蛋白质的两个亚单位相连，形成一个复合物。当两个蛋白质相互作用时，AD和BD也会相互作用，激活报告基因的表达，从而产生可观察的表型。 二、操作步骤 酵母双杂交鉴别的操作步骤主要包括以下几个方面： 1. 构建酵母表达载体：将待测蛋白质的AD和BD亚单位分别克隆到酵母表达载体中，构建AD和BD融合蛋白的表达载体。 2. 转化酵母细胞：将构建好的表达载体转化到酵母细胞中，使其表达AD和BD融合蛋白。 3. 交配：将含有不同AD和BD融合蛋白的酵母细胞进行交配，使

其杂交。 4. 筛选：通过对交配后的酵母细胞进行选择培养基的筛选，筛选出能够表达报告基因的阳性克隆。 5. 验证：通过进一步的实验证实，确定阳性克隆中的相互作用是否真实可靠。 三、应用 酵母双杂交鉴别在蛋白质相互作用研究中有着广泛的应用。它可以用于鉴定蛋白质间的直接相互作用、建立蛋白质相互作用网络、研究蛋白质的功能和信号通路等。此外，酵母双杂交鉴别还可以用于药物筛选和疾病相关蛋白质相互作用的研究。 四、优缺点 酵母双杂交鉴别有以下优点：操作简便、高通量、适用于大规模蛋白质相互作用筛选，可以筛选出潜在的蛋白质相互作用对。然而，酵母双杂交鉴别也存在一定的局限性：可能存在假阳性和假阴性结果，无法鉴定动态和间接的蛋白质相互作用。 五、未来发展方向 随着技术的不断发展，酵母双杂交鉴别也在不断改进和完善。未来的发展方向主要包括以下几个方面： 1. 提高鉴定准确性：通过改进酵母双杂交鉴别的实验设计和筛选条

酵母双杂实验心得体会

酵母双杂实验心得体会 酵母双杂实验心得体会 酵母双杂实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母的基因互作关系和功能调控。在这个实验中，我们采用了一对突变株和一个质粒，通过构建双杂交表达菌株，来研究酵母的蛋白相互作用网络。在实验过程中，我学到了很多知识，也遇到了一些挑战。以下是我对这个实验的心得体会。 首先，这个实验需要精确的技术操作和仔细的实验规划。在实验开始之前，我们需要准备好所有的材料和试剂，确保实验的顺利进行。在操作过程中，尤其是进行基因克隆和质粒转化的步骤，需要非常小心和耐心，以确保实验的准确性和稳定性。同时，实验还需要进行详细的记录和数据分析，以便后续的研究和结果验证。 其次，实验中遇到的最大挑战是对结果的解读和分析。酵母双杂交实验产生的数据量庞大且复杂，需要经过一系列的统计学分析和生物信息学方法，才能从中找出有意义的结果。在这个过程中，我们需要对实验中的不确定性和误差有清楚的认识，并且运用适当的方法对数据进行处理和筛选。同时，我们还需要对实验结果进行合理的解释，结合已有的知识和文献，来推断酵母蛋白的相互作用和功能。 此外，这个实验还需要团队合作和良好的沟通。在实验中，我们需要分工合作，每个人负责不同的步骤和实验操作。团队中的成员需要相互交流和协助，确保实验的顺利进行。此外，团

队中的学生还需要与导师和其他研究人员进行及时的沟通，及时汇报实验进展和问题。通过团队合作，可以提高效率和减少错误，同时也可以促进学习和交流，推动科研的进步。 总而言之，酵母双杂交实验是一种复杂而有挑战性的实验方法，需要精确的操作和细致的实验规划。在实验中，我们不仅学到了很多知识，还提高了实验技术和数据分析的能力。通过这个实验，我们对酵母的蛋白相互作用网络和功能调控有了更深入的了解。实验中的团队合作和沟通也使我们的团队更加紧密和高效。这个实验给我留下了深刻的印象，也让我更加热爱和专注于科研的道路。

酵母双杂交技术

酵母双杂交技术 引言 酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究 蛋白质-蛋白质相互作用。该技术能够检测和分析细胞内发生 的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、 代谢途径和疾病发生机制。本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。 原理 酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表 达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋 白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。 具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤： 1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的 编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化 域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。

2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。 3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交 剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。 4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表 达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达 结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。应用 1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮 助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白 质之间的相互关系和调控机制。 2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛 选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了 解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。 3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物 靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研 发过程。

(完整版)酵母双杂交原理

酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转

酵母双杂交的一些问题

研究蛋白互作的方法 蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧 常用的体外互作研究方法： 1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 ⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。 “假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。 “假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。 体内互作的研究 1、荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的