酵母双杂交系统的发展和应用

酵母双杂交系统的发展和应用

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。

酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了

酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。

基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。

1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin 的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）

众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用

作为后基因组时代出现的新兴研究领域之一, 蛋白质组学(proteomics)正受到越来越多的关注。蛋白质组学的研究目标是对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和结构功能分析。蛋白质组学的研究不局限任何特定的方法。高分辨率的蛋白质分离技术如二维凝胶电泳和高效液相层析, 经典的蛋白质鉴定方法如氨基酸序列分析等, 现代质谱技术, 基因组学研究的各种手段, 现代计算机信息学和计算机网络通讯技术等等, 任何可用于蛋白质研究的技术手段, 蛋白质组学都可能会采用。它体现的是一个开放的思维和研究方式。

蛋白质-蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。这种千变万化的相互作用以及由此形成的纷繁复杂的蛋白质联系网络同样也是蛋白质组学的研究内容, 相应的工作也已经开展。

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)自建立以来已经成为分析蛋白质

相互作用的强有力的方法之一。该方法在不断完善, 如今它不但可用来在体内检验蛋白质间的相互作用, 而且还能用来发现新的作用蛋白质, 在对蛋白质组中特定的代谢途径中蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用。实验表明双杂交技术在蛋白质组学上的应用是成功的。本文将就双杂交技术的产生、发展及其在蛋白质组研究方面的初步应用作一介绍。

1 蛋白质组学的产生背景

基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中, 已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA 的全序列分析［1］。线虫(C.elegans)的基因组DNA测序工作已基本完成［2］。规模更为庞大的人类基因组计划预期在下一世纪的前几年(2003～2005年)也将完成全部基因组DNA的序列分析。这些进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此, 在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。也就是说, 一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下, 蛋白质组学(proteomics)应运而生。

蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的［3］, 最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上［4］, 它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究

的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。关于蛋白质组学的介绍可参阅文献［5,6］。

细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物, 蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法, 常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中, 酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。

2 酵母双杂交系统的建立与发展

双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为D和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB 和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白

的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录［7］。

Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立［8］。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。

目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。 HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的

相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且, 酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。 Bendixen等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率［9］。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型： a接合型和α接合型, 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, “诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要, Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)［10,11］。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。 URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码

的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。 Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白, 即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。

以上介绍的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶II的激活的基础上的。这意味着双杂交过程是在细胞核内完成的。然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白, 它们需定位到膜上之后才能表现正常的生物功能，与其他蛋白质起作用。有些真核细胞蛋白还要经过翻译后的加工修饰如二硫键的形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。这些加工修饰在正常的细胞核内不可能发生。有些蛋白质本身具有激活转录的活性, 它们可不经过双杂交相互作用即能激活报道基因的表达。因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。例如, Aronheim等人设计了一个Sos蛋白介导的双杂交系统［12］, 也被作者称为Sos救活系统(Sos recruitment system)。人的鸟苷酸交换因子-Sos蛋白是一种胞质蛋白, 而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25蛋白定位在内膜上, 可将相关受体信号传导给Ras蛋白。由cdc25突变产生的一种温度敏感突变型细胞不能在36 ℃条件下生长。但是, 如果Sos蛋白可以通过某种方式被定位到酵母细胞内膜上, 那么它在这种温度敏感突变型细胞中因替代

cdc25蛋白的作用, 而使酵母恢复在36 ℃条件下生长的能力。在Aronheim等人设计的系统中, 待研究的两个蛋白质分别与豆蔻酰基化信号片段和Sos蛋白融合, 前一个融合蛋白定位于膜上, 如果两个待研究蛋白质之间存在相互作用, 这将使Sos也定位到膜上, 从而可激活Ras蛋白使酵母在36 ℃下生长。利用该技术Aronheim等人找到了c-Jun的两个新的作用伙伴。

此外还有其他类型的双杂交甚至三杂交系统, 本文不再详述。

3 双杂交系统在蛋白质组研究中的应用

双杂交系统在蛋白质组研究上的应用可以说尚处于尝试阶段, 这方面的文献报道还很少, 但已显示其在分析鉴定细胞内复杂的蛋白质相互作用方面的潜力。这里以两家实验室的工作为例作一介绍。

Fromont-Racine等人［13,14］以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”, 从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行第一轮筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。经过对阳性克隆“猎物”DNA的序列分析, 他们把这些DNA分成两大类共5项(图1)：编码蛋白质的DNA和非编码蛋白质的DNA, 前一类分为四项： A1是在序列上彼此有部分重叠的克隆群。这一项也是首先分析考虑的对象； A2和A3分别是靠近ORF 起始密码子的编码蛋白质N-末端的片段和ORF内部的大编码片段, A4是其他的编码序列。这四项优先考虑的顺序是： A1>A2>A3>A4。根据分析把从中得到的4种靶蛋白做成新的“诱饵”进行第二轮筛选。再把从中得到的一种“猎物”做成“诱饵”进行第三轮筛选。如此经过三轮共十五次筛选, 他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。这些筛选到的靶蛋白中, 有9种是已知

的mRNA前体剪接因子, 5种是新发现的剪接因子, 8种是与RNA其他加工过程有关的因子, 还有45种与其他的功能有关。另外有9种是转录激活因子, 这主要来自假阳性克隆。他们不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用, 鉴定了一些新的因子, 而且建立了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。

据此Fromont-Racine等人声称, 如果选择不同的细胞代谢或信号转导途径为出发点, 通过类似的双杂交实验最终有可能建立酵母细胞完整的蛋白质联系图谱。推而广之, 这项技术同样也能用到人类蛋白质组研究中。

Fromont-Racine等人能在较短的时间完成如此大量的筛选、分析工作, 一个非常关键的因素是他们采用了上述Bendixen等人建立的通过酵母的有性接合得到双杂交菌株, 并且对此技术作了进一步的改进。 Bendixen等人是通过把两种接合型细胞同时复印到一个平板上使之接合；而Fromont-Racine则是把两种细胞直接在滤膜上混合然后铺到选择性平板上, 因此避免了烦琐的复印操作, 使工作效率进一步有所提高［13］。

与此类似, Hudson等人也正在进行酿酒酵母的蛋白质组的研究分析工作［14］。他们把酵母所有的即约6 000多种蛋白质开放读码框(ORF)，分别构建成与DB和AD基因融合的表达载体。两类载体分别转化不同接合型酵母菌株。 6 000株分别表达不同的AD-ORF即“猎物”的细胞在16张384孔微滴定板上培养, 再取少许菌液点在只表达一种BD融合蛋白的细胞形成的菌苔上使两种细胞接合形成二倍体, 然后按照常规的双杂交技术鉴定“诱饵”和AD融合蛋白是否发生相互作用(图2)。整个过程主要是在384孔微滴定板上完成的。和Fromont-Racine等

人的方法相比, 这个方法的优点是操作过程可最大程度地自动化, 微滴定板的使用也大大提高了处理量。这项工作虽已由Frederickson作了介绍, 但目前为止尚未见到它正式发表。根据Frederi-ckson的评论, 这个方法如果成功的话, 那末它很有可能在人类蛋白质组研究中得到应用。

4 结束语

酵母双杂交技术问世不到十年, 但已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等诸方面发挥重要作用。双杂交技术固然有其内在的不足之处, 如通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生, 也即所谓的假阳性；假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题；一些对细胞致命的蛋白质也不适宜通过双杂交系统来分析。双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性, 这种可能还必须经过其他实验验证, 尤其要与生理功能研究相结合, 否则可能会误入歧途。虽然如此, 该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必要手段。技术的发展与创新、研究成果的迅速共享为建立有机体的全部蛋白质(蛋白质组组分)的相互作用及其功能关系图谱提供了基础和条件。我们不奢望通过双杂交系统能发现所有真实的蛋白质相互作用, 但在没有更好的方法问世之前, 双杂交技术仍是开展这类研究的有力工具。

酵母双杂交系统原理的应用

酵母双杂交系统原理的应用 1. 什么是酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。这个系统利用酵母细胞中的转录因子和报告基因来实现。当两个蛋白质相互作用时，可以触发报告基因的表达，从而显示出它们之间的相互作用。 2. 酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统的原理主要基于透明质酸选择活化子（activation domain）和DNA 结合结构域（DNA-binding domain）相互作用。这种相互作用会激活基因的表达，从而触发报告基因的产生。酵母细胞中通常包含两个重要的部分：转录因子DNA 结合结构域（DBD）和活化因子 DNA 结合结构域（AD）。 •转录因子 DNA 结合结构域（DBD）：该结构域能够识别和结合目标DNA序列，从而调控基因的转录。 •活化因子 DNA 结合结构域（AD）：该结构域能够激活特定的报告基因的表达。 当两个蛋白质相互作用时，将目标蛋白质的DBD域与AD域融合到一个融合蛋白中。当这个融合蛋白与另一个蛋白质结合时，就会形成一个激活结构，从而使报告基因得以表达。 3. 酵母双杂交系统的应用 酵母双杂交系统在生物学研究中应用广泛。以下列举了一些常见的应用领域： 3.1. 蛋白质-蛋白质相互作用的研究 利用酵母双杂交系统，研究人员可以快速筛选并确认蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。通过构建大规模的蛋白质库，可以鉴定出蛋白质与蛋白质之间的相互作用网络。这有助于理解蛋白质相互作用对于细胞的功能和调控的作用。 3.2. 蛋白质-小分子相互作用的筛选 酵母双杂交系统也可以用于筛选蛋白质与小分子之间的相互作用。研究人员可以将小分子与AD结构域融合，并与目标蛋白质库进行酵母双杂交筛选。这有助于发现新的药物靶点，并加速新药的开发过程。

酵母双杂交的一些问题

研究蛋白互作的方法 蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧 常用的体外互作研究方法： 1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 ⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。 “假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。 “假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。 体内互作的研究 1、荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统及其应用 Yeast Two-hybrid System and Its Application 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 germinate，v.发芽, 发育, 使生长 spore，n.孢子vi. 长孢子

酵母双杂交系统的发展和应用

酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了

酵母双杂交

酵母双杂交的原理 Fields 与Song于1989年首先创立。典型的真核生长转录因子（如GAL4），都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 酵母双杂交的应用 1研究已知蛋白质与蛋白质间的相互作用2确定蛋白质功能区：对基因进行系列突变，通过检测其蛋白质相互作用的变化，确定功能区3确定未知蛋白质间的相互作用：从cDNA文库中与已知蛋白结合的未知蛋白，将cDNA与AD结合，已知蛋白与BD结合，检测报告基因的转录4确定基因治疗中多肽药物的作用机理： 酵母双杂交系统优点 （1）快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（3）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（4）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（5）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。6双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，优点： 根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白。蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来。可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。 酵母双杂交系统局限性 1许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。2有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。3酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。4某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。5某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。局限性： ?表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确 ?本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统 ?不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统 ?需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统 LexA酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait) 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura 筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性4-1. 如果pLexA-X 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母 5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。 5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋

酵母双杂交

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点… 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点的双杂交系统（如Sos蛋白招募系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统和断裂-泛素为基础的双杂交系统）以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统（如以polⅢ为基础的杂交系统和RTA系统）等在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性，扩大了被研究的蛋白质的范围，提高了系统的灵敏度。酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。 一、酵母双杂交系统原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（DNA binding d omain，简称为DB）和转录激活结构域（activation d omain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域（如GAL4-bd，LexA-bd）；另一个基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad，VP16）。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交实验常见问题 1.如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？ 在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重

酵母双杂交技术

在生命活动中， DNA的复制、转录、RNA的剪接、蛋白质的翻译和分泌以及细胞周期的调节、信号传导和诸多代谢过程都是各种相关蛋白质有机相互作用的结果。细胞或组织中的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。随着分子生物学实验技术的飞速发展，近10年来，发展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song创立的酵母双杂交技术为最佳。该方法利用酵母生长速度快，且容易操作的特点，在其体系中研究哺乳动物细胞的蛋白--蛋白间的相互作用，通过筛选cDNA文库，找到与感兴趣蛋白相互作用的蛋白。 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。

酵母双杂交的作用

酵母双杂交系统 酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和 Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map） 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析

酵母双杂交技术应用进展

酵母双杂交技术应用进展 酵母双杂交技术是一种强大的生物技术方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。这项技术自20世纪80年代问世以来，已经广泛应用于基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域。本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用进展及未来展望。 酵母双杂交技术是基于真核生物体内两个互补的转录因子，即GAL4和DBD-VP16，以及一个含有报告基因的载体穿梭质粒构建而成的。在该技术中，一个转录因子（DBD-VP16）与一个诱饵蛋白结合，另一个转录因子（GAL4）与目标蛋白结合。当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，两个转录因子将形成一个复合物，该复合物将激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况，可以确定蛋白质之间的相互作用。 基因功能研究 酵母双杂交技术已成为研究基因功能的重要工具。通过使用该技术，科学家们可以筛选出与特定基因相互作用的其他基因，从而揭示基因在细胞中的功能。例如，一项研究发现人类肺癌细胞中抑癌基因TP53的相互作用蛋白，从而为肺癌治疗提供新的思路1。

在药物研发方面，酵母双杂交技术也发挥了重要作用。通过该技术，科学家们可以筛选出能够与特定药物靶点相互作用的小分子化合物，从而发现新的药物候选。例如，利用酵母双杂交技术成功发现了一种能够抑制乳腺癌细胞增殖的新药候选2。 酵母双杂交技术在生物技术应用方面也具有广泛的应用价值。例如，利用该技术成功克隆了一个编码具有工业应用价值的酶的基因，并实现了该基因的高效表达3。酵母双杂交技术还被用于构建具有重要应用价值的基因调控网络。 随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。在基因组学领域，利用酵母双杂交技术可以揭示基因之间的相互作用和调控关系，有助于深入理解生命活动的复杂性。在蛋白质组学领域，酵母双杂交技术可以应用于蛋白质相互作用的研究，为揭示生物学过程和疾病机制提供有力支持。在代谢组学领域，酵母双杂交技术可以帮助研究代谢物之间的相互作用和调控机制，为代谢调控和代谢性疾病研究提供新的视角。 酵母双杂交技术是一种非常有用的生物技术方法，在基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域均具有广泛的应用价值。随着相关研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。未来可以进

酵母双杂交技术的原理及其应用

酵母双杂交技术的原理及其应用 1. 引言 酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。 2. 原理 酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。其基本步骤如下： 1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载 体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。 2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录 因子的表达。 3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列， 使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。 4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若 目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。 3. 应用 3.1 蛋白质相互作用研究 酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。 3.2 酶底物筛选 酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。 3.3 药物靶点筛选 利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。

酵母双杂交技术

酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由 113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激 活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别

酵母双杂交技术

酵母双杂交技术 引言 酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究 蛋白质-蛋白质相互作用。该技术能够检测和分析细胞内发生 的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、 代谢途径和疾病发生机制。本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。 原理 酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表 达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋 白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。 具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤： 1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的 编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化 域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。

2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。 3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交 剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。 4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表 达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达 结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。应用 1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮 助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白 质之间的相互关系和调控机制。 2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛 选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了 解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。 3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物 靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研 发过程。

酵母双杂的原理及应用

酵母双杂（Hybrid Yeast）的原理及应用 1. 引言 酵母是一类单细胞真菌，广泛应用于食品、药品和酿造等领域。酵母双杂（Hybrid Yeast）是利用不同类型的酵母进行交配培育出的一种新型酵母。本文将从酵母双杂的原理和应用两个方面进行介绍。 2. 酵母双杂的原理 酵母双杂是通过将两个不同的酵母菌株进行交配，融合不同的基因组合来实现的。酵母双杂的原理主要包括以下几个步骤： •菌株选择：选择两个质态互补的酵母菌株作为双杂交配的材料，通常选择具有不同性别的菌株，如雄性和雌性，以增加交配概率。 •受精：将选定的酵母菌株分别培养在含有营养物质的培养基上，培养基中的营养物质可以刺激菌株的生长和繁殖。通过培养，使酵母菌株达到一定的生长周期后，将雄性酵母菌株的细胞液与雌性酵母菌株的细胞液混合，实现受精。 •融合：经过受精后的酵母菌株会发生细胞融合，合并两个菌株的基因组，形成新的酵母双杂。 •筛选：对融合后的酵母双杂进行筛选，通过培养基中添加相应药物来筛选能够生长和繁殖的酵母双杂，去除无法存活的酵母菌株。 •稳定化：经过筛选后，将生长良好并符合要求的酵母双杂进行稳定化处理，使其具有较稳定的遗传特性。 3. 酵母双杂的应用 酵母双杂在许多领域中都有广泛的应用。以下是酵母双杂的几个应用方面：•食品工业：酵母双杂可以用于酵母发酵食品的生产，如面包、啤酒和酸奶等。通过融合不同的酵母菌株，可以增加食品的品种和口感。 •药品生产：酵母双杂在药品生产中起到重要的作用。利用酵母双杂可以合成多种药物原料，如抗生素、维生素和氨基酸等。通过优化菌株的基因组合，可以提高药品生产的效率和产量。 •酿造业：酵母双杂在酿酒过程中起到关键作用。不同的酵母菌株具有不同的发酵特性，通过酵母双杂可以培育出更适合酿酒的菌株，提高酿酒的质量和口感。

酵母双杂技术的原理和应用

酵母双杂技术的原理和应用 一、酵母双杂技术的原理 酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面： 1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂 交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。 2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基 因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。 3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补 DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补 DNA库中的DNA发生相互作用。然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。 二、酵母双杂技术的应用 酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面： 1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标 蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。 2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互 作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。 3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作 用的蛋白，从而推断目标基因的功能。这有助于揭示基因的调控机制和功能。 4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关 的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。 5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关 的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。

酵母双杂交技术

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酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1

蛋白检测篇-酵母双杂交系统分享

编号：1-8 主题：酵母双杂交系统 概述： 酵母双杂交由Fields在1989年提出，他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，分别是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构（transcription machinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系

统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。酵母双杂交系统仍存在一些局限性：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。 目的： 1.发现新的蛋白质和蛋白质相互作用； 2.在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用； 3.筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响； 4.建立基因组蛋白连锁图， 原理： 酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域DNA 结合域(DNA binding domain ,BD)和的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD或AD不