LexA酵母双杂交系统简介
LexA酵母双杂交系统简介
一、LexA酵母双杂交系统的设计原理
报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成
1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库
2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）
3.大肠杆菌菌株：E.coli KC8株
4.对照质粒：
质粒用途
pLexA-53，pB42AD-T阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)假阳性检测质粒
5.引物：
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程
1.将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2.同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3.构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4.将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura蓝阳性对照
pLexA SD/-His，-Ura白阴性对照
PlexA-X SD/-His，-Ura白没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura蓝具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura菌落不能生长酵母细胞毒性
4-1.如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2.如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
5.如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转化质粒SD固体培养基LacZ表型
对照1pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura蓝
对照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu蓝
＋pB42AD-T
实验pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待测
＋pB42AD-文库
5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
-半乳糖苷酶无表达。 5-2.上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但
5-3.同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4.将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6.阳性克隆的筛选
6-1.随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2.如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。
7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆
7-1.将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。
C孵育2-3天。 7-2.将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30
7-3.再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His 表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4.将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。
8.酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆
如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
质粒1
(in YM4271)质粒2
(in EGY48)LacZ表型Leu表型
pLexA pB42AD白不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD白不能生长
pLexA pB42AD-文库白不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD-文库蓝真阳性
pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长
9. 阳性克隆的进一步筛选和确证
9-1.扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。
9-2.将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。
9-3.用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。
9-4.扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。
10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究
10-1.用不同的双杂交系统验证
10-1-1.将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。
10-1-2.选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。
10-1-3.将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。
-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。 10-1-4.去除或突变特定结合位点，定量检测
10-2.用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。
10-3.用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。
10-4.进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系
构建于AD载体的cDNA文库的扩增
1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，臵于冰浴中缓慢化冻。
2.用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。
l l加入90 3.取稀释菌液各10 90mm)；37℃倒臵培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。 LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(
4.确定待扩增的cDNA文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)。
5.按照>150mm)，共100块；37℃倒臵培养过夜。 2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp 平板(
6.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml LB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。
7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。
8.其余培养菌液离心8000xg×10min，4℃收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。
LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15min
A.bacto-Tryptone10.0g
B.bacto-Yeast Extract 5.0g
C.NaCl10.0g
D.ddH2O →1000 ml
* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。
** LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。 50-100
构建于AD载体的cDNA文库的纯化
1.质粒DNA提取缓冲液
名称缓冲液配方
g/ml RNase P1悬浮缓冲液50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 A
P2裂解缓冲液200mM NaOH；1% SDS
P3中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5)
QBT平衡缓冲液750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇；0.15% Triton X-100
QC洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇
QF洗脱缓冲液 1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl(pH8.5)；15%异丙醇
2.培养菌液离心6000xg×10min，4℃，每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。
3.加入50ml P2缓冲液，倒臵4-6次混匀，室温孵育5min。
4.加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒臵4-6次混匀，冰浴30min(其间再倒臵混匀4-6次)。
5.将上述混合液再倒臵混匀，离心12000xg×30min，4℃，保留上清。
6.上清再离心12000xg×15min，4℃，留上清。
7.将上清液上样于经35ml QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。
8.以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次。
9.以35ml QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。
10.以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。
11.以7ml 70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。
12.将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE(pH8.0)缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；1/10体积3.0M NaAc(pH5.2)，于-20℃静臵过夜。
13.离心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。
l)，保存于-20℃。 g/管(用于1次转化反应，约40 14.干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200
构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞
1.将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Difco Nitrogen0.67g
B.葡萄糖 2.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
D.20×His 5.0ml
E.20×Leu 5.0ml
F.20×Trp 5.0ml
G.ddH2O →100.0ml
2.将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Polypepton 6.0g
B.bacto-Yeast Extract 3.0g
C.葡萄糖 6.0g
D.ddH2O →300 ml
3.室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
4.准备下列试剂
2×转化反应10×TE10×LiAc50% PEG ddH2O
l l/120 l15 A.1×TE/LiAc0.15ml15
l/ l960 l120 B.PEG/LiAc 1.20ml120
l l//900 C.1×TE 1.00ml100
5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀。
l g)3-5 A.pLexA-X(0.1
B.10mg/ml l Sperm DNA*(0.1mg)10
新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。 6.每管加入100
l 7.各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l 8.各加入70 DMSO缓和倒臵混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9.室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His固体培养板，30℃倒臵培养3-5天。
SD/-Ura，-His固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A.Difco Nitrogen 1.34g
B.葡萄糖 4.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)20.0ml
D.20×Leu10.0ml
E.20×Trp10.0ml
F.Agar 4.00g
G.ddH2O 90-100mm) →200.0ml铺8-10块平板(
附表1. 不同规模转化酵母感受态细胞
Small Scale*Large Scale Library Scale
转化反应2011
(1)SD液体培养基扩增酵母菌100ml100ml300ml
(2)YPD液体培养基扩增酵母菌300mla300mla1000mla
(3)TE或ddH2O洗涤酵母细胞15mlc25-50mlb500mla
(4)准备 A. 1×TE/LiAc缓冲液 1.5mld 1.0mld8.0mlc
B. PEG/LiAc缓冲液12.0mlc 6.0mlc100.0mlb
C. 1×TE缓冲液 6.0mlc10.0mlc10.0mlc
(5)分装 A. DNA-BD vector gd×20/0.2-1.0mgc 0.1
gd0.1-0.5mg g×2010-50 B. AD vector0.1
C. l 2.0ml l×20200 Sperm DNA(10mg/ml)10
1×TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5mlc 1.0mlc8.0mlb
l×20 1.0ml8.0ml 酵母感受态细胞100
(7)PEG/LiAc缓冲液0.6ml×20 6.0ml60.0ml
l7.0ml l×20700 DMSO70
(9)室温离心后弃上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min
(10)1×TE重悬感受态细胞0.3ml×20 6.0ml10.0ml
150mm×50 150mm×30 90mm×20 铺固体选择培养基平板
注: * 即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”
** 在不同容积的无菌离心管中进行，a: 300或500ml；b: 50ml；c: 15ml；d: 1.5ml
文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞
1.以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。
2.将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura，-His液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Difco Nitrogen0.67g
B.葡萄糖 2.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
D.20×Leu 5.0ml
E.20×Trp 5.0ml
F.ddH2O →100.0ml
3.将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Polypepton 6.0g
B.bacto-Yeast Extract 3.0g
C.葡萄糖 6.0g
D.ddH2O →300 ml
4.室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5.准备下列试剂
1×转化反应10×TE10×LiAc50% PEG ddH2O
l l/800 l100 A.1×TE/LiAc 1.0ml100
l 4.8ml/ l600 B.PEG/LiAc 6.0ml600
C.1×TE10.0ml 1.0ml//9.0ml
6.取1.0ml用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。
l g)40 A.pB42AD-Library(50-100
B.10mg/ml l Herring DNA*(2.0mg)200
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
7.加入6.0ml PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l 8.加入700 DMSO缓和倒臵混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9.室温离心2000xg×5min，尽量弃上清。
10.以6.0ml 100mm，每稀释度各×2)，30℃倒臵培养3-5天，确定转化效率在2×106cfu 以上有效。 l稀释不同倍数，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板( 1×TE重悬沉淀细胞，取10
150mm×30)，30℃倒臵培养3-5天。 l涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板( 11.按每板200
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A.Difco Nitrogen13.40g
B.葡萄糖40.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)200.0ml
D.20×Leu100.0ml
E.Agar40.00g
F.ddH2O 150mm) →2000.0ml铺30块平板(
12.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5ml TE(pH7.0)缓冲液，将菌落刮下。
13.离心弃上清，加入10-20ml TE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，分装1.0ml/管，保存于4℃ 1周或-80℃1年以上。
65%甘油-MgSO4缓冲液: 65%甘油；100mM MgSO4；25mM Tris-HCl(pH8.0)
A.甘油65.00ml
B.MgSO4•7H2O 2.465g
C. 2.0 M Tris-HCl(pH8.0) 1.25ml
D.ddH2O →100.00ml
酵母双杂合系统阳性克隆的筛选
1.经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度。
90mm)，30℃倒臵培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。 l，涂布SD/-Ura，-His，-Trp 固体培养板( 2.取上述稀释菌液各100
3.确定待进一步鉴定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆数×105(1:104稀释)、克隆数×107(1:106稀释)或克隆数×109(1:108稀释)。
4.按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒臵培养3-5天。
5.挑取显蓝色的菌落，再接种于SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。
SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A.SD/Gal/Raf 3.79g
B.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
C.Agar 2.00g
D.ddH2O →85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E.10×BU 10.0ml
F.20mg/ml X-gal0.4ml 90-100mm) 铺5-6块平板(
10×BU缓冲液，121℃，15lb/in2灭菌15min
A.Na2HPO4•12H2O9.30g
B.NaH2PO4•2H2O 3.90g
C.ddH2O →100.0ml
20mg/ml X-Gal
A.X-Gal40mg
B.DMF2ml
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA的提取
1.挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。
SD/-Trp液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Difco Nitrogen0.67g
B.葡萄糖 2.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
D.20×His 5.0ml
E.20×Leu 5.0ml
F.20×Ura 5.0ml
G.ddH2O →100.0ml
2.室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。
l酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。 3.加入200
酵母裂解液: 2% Triton X-100；1% SDS；100mM NaCl；10mM Tris-HCl(pH8.0)；1mM EDTA
A.10% Triton X-10020.0ml
B.10% SDS10.0ml
C.NaCl0.58g
D.Tris0.12g
E.EDTANa2•2H2O0.04g
F. 1.0M HCl调pH8.0
G.ddH2O →100.0ml
4.加入下列试剂，充分振荡5min；液氮冻存10min，室温复融；再充分振荡5min。
A.经酸处理的玻璃珠(Sigma)0.20g
B.苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)0.2ml
5.室温离心12000xg×10 min，将上清转移至新的1.5ml 离心管中，加入下列试剂，于-70℃冻存30-60 min。
A. 3 M NaAc(1/10 l V)20
l B.无水乙醇(2.5V)500
6.离心12500xg×10 min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于 37℃烘箱或超净台干燥DNA；将干燥的沉淀DNA重溶于 l无菌ddH2O中，保存于-20℃。 20-30
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌
1.在冰浴条件下，取待转化DNA l感受态细胞中，混匀。 g)，加入100 l(5pg-0.5 1.0
F，200 2.将上述混合液加入间距0.1cm的样品杯中，电转化(1.8kV，25。
3.迅速加入1ml新鲜的LB培养液，混匀，转入1.5ml 离心管中，37℃恒温，150rpm振荡孵育30-60min。
4.将上述转化反应液涂布M9/DO(-Trp)固体培养板，37℃倒臵培养至单菌落出现(16-22hr)。
5.按常规方法扩增上述阳性转化菌，碱裂解法少量抽提质粒DNA，酶切筛选AD载体上含有插入片段的阳性克隆，保存其于25%甘油，待进一步验证。
M9/DO-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.葡萄糖 1.2g
B.Agar 6.0g
C.5×M9缓冲液60 ml
D.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)30 ml
E.20×His15 ml
F.20×Leu15 ml
G.20×Ura15 ml
H.ddH2O 165 ml
冷却至50℃左右，加入下列成份，混匀铺板
I. 1.0M Thiamine-HCl(Vit.B1)0.3 ml
J.100mg/ml Amp0.3 ml 90-100mm) 铺10-15块平板(
大肠杆菌感受态细胞的制备(电转化)
1.挑取LB固体培养基上生长的E.coli KC8单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。
2.将 2.5 ml新鲜菌液接种于500ml SOB培养液中，37℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6(约2.5-3hr)。
SOB液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.bacto-Tryptone10.00g
B.bacto-Yeast Extract 2.50g
C.NaCl0.25g
D.KCl0.09g
E.MgCl2•6H2O 1.02g
F.ddH2O →500.0ml
3.将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min。
4.离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清；以5ml 预冷的无菌ddH2O重悬沉淀菌；再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。
5.重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成份。
6.用40-50ml 预冷的无菌10% 甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml 无菌离心管中；离心6000xg ×10min，4℃，弃尽上清；重复此步骤1次。
7.以等体积(约1.5-2.0ml) 预冷的无菌10% 甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装0.5ml/管(5-6次转化反应)，保存于-80℃备用。
酵母双杂合系统阳性克隆的确证
1.以含有报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。
2.将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Difco Nitrogen0.67g
B.葡萄糖 2.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
D.20×His 5.0ml
E.20×Leu 5.0ml
F.20×Trp 5.0ml
G.ddH2O →100.0ml
3.将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm 振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A.Polypepton 6.0g
B.bacto-Yeast Extract 3.0g
C.葡萄糖 6.0g
D.ddH2O →300 ml
4.室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5.准备下列试剂
20×转化反应10×TE10×LiAc50% PEG ddH2O
l/ 1.2ml l150 A.1×TE/LiAc 1.5ml150
B.PEG/LiAc12.0ml 1.2ml 1.2ml9.6ml/
C.1×TE10.0ml 1.0ml//9.0ml
6.分装待转化的质粒DNA。
A.pLexA l g)3-5 or pLexA-X(0.1
l g)3-5 B.pB42AD-Y(0.1
C.10mg/ml Sperm l DNA*(0.1mg)10
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。 7.每管加入100
l 8.各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l 9.各加入70 DMSO缓和倒臵混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
10.室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板，30℃倒臵培养3-5天。
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A.Difco Nitrogen 3.35g
B.葡萄糖10.00g
C.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)50.0ml
D.20×Leu25.0ml
E.Agar10.00g
F.ddH2O →500.0ml 90-100mm) 铺20-25块平板(
11.挑取上述固体培养基上生长的含有目的DNA(X)的pLexA-X(+)或空载pLexA(-)单菌落，分别接种SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒臵培养3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A.SD/Gal/Raf 3.79g
B.10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)10.0ml
C.Agar 2.00g
D.ddH2O →85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E.10×BU 10.0ml
F.20mg/ml X-gal0.4ml 90-100mm) 铺5-6块平板(
12.选择含有pLexA-X显蓝色，而相应的不含有插入DNA的空载pLexA显白色的克隆，扩增其在E.coli KC8中的甘油菌，按常规抽提质粒DNA，进行序列分析。
10×DO(-His，-Trp，-Leu，-Ura)
为不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。
每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。
(1)L-Isoleucine L-异亮氨酸300mg
(2)L-Valine L-缬氨酸1500mg
(3)Adenine腺嘌呤200mg
(4)L-Arginine HCl L-精氨酸200mg
(5)L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐300mg
L-Methionine L-甲硫氨酸200mg
(7)L-Phenylalanine L-苯丙氨酸500mg
L-Threonine L-苏氨酸2000mg
(9)L-Tyrosine L-酪氨酸300mg
20×氨基酸储存液
每100ml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4℃。
20×His L-Histidine L-组氨酸40mg
20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸40mg
20×Leu L-Leucine L-白氨酸200mg
20×Ura Uracil尿嘧啶40mg
酵母转化缓冲液:
缓冲液体积缓冲液配制
10×TE100ml Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 80ml；盐酸调pH7.5；ddH2O定容
10×LiAc100ml LiAc•2H2O 10.20g；ddH2O 50ml，冰醋酸调pH7.5；ddH2O定容
50% PEG100ml PEG3350 50.0g；ddH2O定容
其它缓冲液:
缓冲液体积缓冲液配制
TE1000ml Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH；ddH2O定容STE1000ml NaCl 5.84g；Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH8.0；ddH2O定容
人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)的研究进展（发表在药物生物技术2001 Vol.8 No.6）
1. Mn-SOD的结构与理化性质
....超氧化物歧化酶存在于所有好氧代谢的细胞中，而专性厌氧菌却缺少这种酶，因为该酶的主要生理功能是防御由好氧代谢反应过程中产生的O2.-带来的损伤。
....该酶催化以下反应[1]：
....O2.-+ O2.-+2H+→H2O2+O2
....到目前为止已经发现4种不同的SOD[2]，其中之一是位于细胞质和真核生物线粒体膜内空间的含有铜和锌的SOD，即CuZn-SOD，这种SOD的例子之一就是存在于牛和人红细胞中的血球铜蛋白（erythocuprein）；有2种SOD含有锰，其中之一存在于线粒体基质中[3]，另外一种存在于微生物如大肠杆菌[4]和链球菌属的突变株[5]的基质中；第4种SOD含有铁，存在于大肠杆菌的周质空间中[6，7]。
....Mn-SOD是位于线粒体中的抗氧化酶，和CuZn—SOD一样具有清除超氧阴离子的作用。....Mn-SOD 的CD谱表明，其含有的α-螺旋结构为45%—61%，而较少β-折叠，大约为27%—34%。由一级结构预测的二级结构表明，Mn-SOD 中不可能存在象CuZn-SOD中那种八股反平行的β-折叠，也不存在长的松散环，整个结构比较紧凑。Mn-SOD 的初步X-射线晶体结构分析已经表明，Mn-SOD 每个结晶学不对称单位含有一个酶分子。ESR和NMR研究揭示Mn-SOD 中的金属离子是处于高自旋状态的3价锰Mn 3+。Mn-SOD 的金属辅基上结合有一个水分子，这一水分子的存在可能与催化机理有关。金属辅基对蛋白质结构有稳定作用，而且与Mn-SOD 的活性直接相关。Mn-SOD晶体的电子密度图分辨率为0.21nm[8]，每个亚基包含两个结构域，N-末端结构域由2个长的反平行螺旋（残基21-25和残基69-89）所占据，另一个结构域即C-末端结构域（残基100-203）是一个α+β桶结构，其中还包含有一个三链折叠。对于Mn-SOD 的折叠和功能可能有重要作用的结构特征是：
....（1）在第一个长的螺旋之前的扭角处有一个顺时针扭转；
....（2）在30位处插入一个残基，使第一个Mn的配基附近的螺旋发生变形；
....（3）位于结构域连接处（残基92-99）和短交叉链连接处（残基150-159）的甘氨酸和脯氨酸连接两个β-折叠链，结构域和结构域之间的连接作用包括组氨酸之间的盐桥、酸性链、疏水相互作用以及至少10个氢键。金属结合位点就在这2个结构域之间。围绕活性中心的是几个保守的芳香族氨基酸，其中有3个Tyr和2个Phe，都在距金属离子1nm的范围内。在Mn-SOD中，83位和160位的氨基酸在空间结构上距离很近。为了适应这个结构，Mn-SOD 中与160位Gln相邻的82、83位氨基酸是体积较小的Gly。任何生物来源的Mn-SOD的一级结构的同一性都很高，且均不同于CuZn-SOD的序列。如人Mn-SOD和鼠、大肠杆菌的Mn-SOD 的同一性分别为94%和43%，不仅如此，参与形成活性中心及与金属连接的氨基酸在所有Mn-SOD中也都是保守的，而且与金属锰相连的氨基酸也完全一致，它们是组氨酸26、87、181和天冬氨酸185。Mn-SOD中残基26-31为HHTKHH，即有4个组氨酸（H）残基靠得很近，其中的3个在所有测定的Mn-SOD中相同部位上都被保留下来。
....图1.1 Mn-SOD活性部位中Mn与氨基酸残基的连接
....Fig.1.1 The contact of Mn and amino acid in the active center of Mn-SOD ....Mn-SOD与Fe-SOD的酶蛋白分子结构颇为类似。Harris对7种不同来源的微生物中提取的5种Fe-SOD与2种Mn-SOD的N末端进行序列分析，并和已经发表学术论文中多种来源Mn-SOD与Fe-SOD的N末端相比较，其结果表明两类酶的一级结构具有高度同一性。用McLachlan方法由一级结构预测二级结构模型表明两类酶分子中活性部位结构颇为类似。从T.thermophilus提纯的Mn-SOD活性部位中Mn与His28、His83、His169、Asp165相连接（见上图）。从E.Coli提纯Fe-SOD活性部位中Fe也与3个组氨酸残基与1个天冬氨酸残基配位。另外，金属离子均尚与1个水分子连接。值得重视的是尽管Mn-SOD与Fe-SOD的酶蛋白分子结构类似，但对于去除Mn的酶蛋白，Fe却不能有效地与Mn竞争，这说明两类酶蛋白对金属离子仍有高度专一性，由此可见Mn-SOD与Fe-SOD的酶蛋白分子结构虽颇类似，但不完全相同。
....图1.2 Mn-SOD与Fe-SOD的亚基结构图
....Fig.1.2 The figur of subunit of Mn-SOD and Fe-SOD
....hMn-SOD多为四聚体，四聚体蛋白结合在一起只有2种类型的相互作用，一种是外伸的非结晶的二联体，另一种作用是结晶的二联体。每个金属位点都被完全占据，Mn-SOD（Ⅲ）形成一个5纵线的三角锥形几何体，一个轴向配基是可溶的，四个蛋白配基是His28,His83,Asp165,His169。围绕金属配位簇的是一个由来自于两条链的对称单位（Phe86A，Trp87A，Trp132A，Trp168A，Tyr183A，Tyr172A，Try173B）的疏水残基占优势的框架。金属离子的附近有一个“口袋”，由His33，Trp87，His83和Tyr36组成。金属离子深深地嵌入到蛋白之中，并且金属离子被2个保守的氨基酸残基His32和Tyr36所屏蔽。Mn（Ⅲ）附近的电荷分布表明第五个配位体可能是OH-而不是H2O。比较Mn（Ⅲ）和Mn（Ⅱ）氧化状态的结构发现二者没有明显区别。
....Mn-SOD四聚体蛋白的A、B链构成了晶体的非对称单位，A/B链的配对结合形成了金属结合位点和物质进出活性部位的通道。A/B链通过氢键（Glu169A-His170B以及His32A-Tyr173B）相连接，而A/C之间的结合是由一些短螺旋（残基48-68，138-141，157-160）之间形成的“篮子”来实现的，3个水分子参与了这种结合作用，A、D之间，B、C之间没有联系，A/D之间的唯一接触则是通过晶体二联体之间的溶剂实现的(见下图)。实际上，Mn-SOD 是一个非常开放的结构，其中心有一个很大的空穴，空穴当中充满着溶剂。
....图1.3 Mn-SOD四聚体的排列
....Fig.1.3 The arrangement of the tetramer in the tetramer of Mn-SOD
....hMn-SOD在不同组织中的含量不同，肝脏中含量最高，其次是心脏、肾上腺和胰脏[9]。
分子质量大于CuZn-SOD，大约为88Kd，每个亚基的相对分子质量一般为19-22kd，大于CuZn-SOD亚基的相对分子质量，按照Mn-SOD的锰含量，计算其亚基所含的锰原子数，则其每个亚基含0.5-1.0个锰原子。
Mn-SOD的氨基酸组成见表1.1。由表中数据可见，线粒体与藻类或菌类的Mn-SOD在氨基酸组成上是类似的，这表明线粒体可能在进化过程中来源于原核生物。将CuZnSOD与线粒体Mn-SOD相比较，前者的甘氨酸（Gly）含量高于后者，但是每个亚基仅有1个酪氨酸（Tyr），而Mn-SOD的结构特征是含有少量的半胱氨酸（Cys），含有较多的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr），因此紫外吸收光谱类似一般的蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，可见吸收光谱在475nm 附近有最大吸收峰，但是随种属来源不同而有一些变动，主要原因是Mn的电荷状态可能不完全为Mn（Ⅲ），后者的氧化还原均可影响可见光吸收性质。
....表1. Mn-SOD的氨基酸组成
....Tab.1 The amino acid composition of Mn-SOD ....................................氨基酸残基数/亚基
氨基酸残基牛肾上腺线粒体水生栖热菌酵母大肠杆菌链球菌小鸡肝线粒体
赖氨酸 11 11 19 15 10 12
组氨酸 8 8 7 6 6 7
精氨酸 6 7 4 5 3 5
天冬氨酸 20 16 28 21 21 19
苏氨酸 6 7 11 9 10 10
丝氨酸 10 4 8 11 4 10
谷氨酸 24 22 28 18 22 19
脯氨酸 8 6 10 8 7 8
甘氨酸 21 17 19 13 12 16
丙氨酸 18 23 21 24 29 13
缬氨酸 11 12 14 10 12 11
甲硫氨酸 1 3 1 2 2 3
异亮氨酸 11 8 12 7 12 8
亮氨酸 18 19 20 19 19 17
酪氨酸 8 10 9 6 8 8
苯丙氨酸 6 7 6 9 7 5
半胱氨酸— 0 3 —— 2
色氨酸 5 6 11 —— 5
....Mn-SOD的热稳定性视不同来源而定，从人肝中提取的Mn-SOD在65-70℃加热数分钟，其酶活力丧失很少。这种耐热性，一方面与金属辅基存在有关，同时与这些酶中不含半胱氨酸残基（C）有关。pH的变化同样能够影响Mn-SOD稳定性，因为pH的改变可引起金属辅基的解离和酶蛋白的电荷状态的变化。一般情况下Mn-SOD溶液（0.35mg/mL）在23℃下保温12h，在pH4.0-10.5范围内不丧失酶活性，而且只要保持在中性（pH>5），即使在8mol/L尿素和10mmol/L EDTA存在下也是稳定的；但是当pH降到3-4时，在有上述试剂存在下就发生解聚和活力丧失。Mn-SOD对十二烷基磺酸钠（SDS）和乙醇-氯仿溶液敏感，对氰化物不敏感，在25℃接触5%triton X-100或5mM/L H2O2，该酶活性不受明显影响，可以借此与CuZn-SOD 和Fe-SOD相区分。
2. 超氧化物歧化酶与进化
....在地球发展史上，地壳外原先没有氧气，此时地球上的生物为绝对厌氧菌。所谓绝对厌氧菌就是这类菌不能在有氧环境中存活，其体内不含有SOD。如果外环境有氧气，O2可进入
体内产生某些对绝对厌氧菌有害、甚至致命的O2.-、.OH等活性氧。随着地球年龄增长，地壳外有了氧气，虽然开始时O2量甚少，但势必使多种绝对厌氧菌大量死亡，甚至灭种。有少量绝对厌氧菌在无氧的外环境中存活，繁衍至今，其中有个别绝对厌氧菌可能会遇到有氧环境，为了适应生存需要，遂含有极少量Fe-SOD。有些绝对厌氧菌为了适应外环境存在的氧气就进化为耐氧厌氧菌，再进化为需氧菌，这些菌含有Fe-SOD和Mn-SOD。随着生物的进化，某些原核生物、藻类、植物和动物体内存在CuZn-SOD。值得重视的是，除CuZn-SOD外，尚存在Mn-SOD。不过，CuZn-SOD一般存在于胞浆中，而Mn-SOD存在于线粒体中。线粒体有多种功能，其中细胞色素氧化酶可催化98% O2直接接收4个电子与4个氢离子（即质子）还原为水，它成为机体防御O2转变为活性氧的首要手段，而且含有的Mn-SOD起到清除O2.-的重要作用。我们认为在进化过程中，源于原核生物的线粒体存在于高等生物体如哺乳类，不是一种偶然，而是一种必然，符合生物进化的原则。
3. 锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的生物合成及其调节
....原核生物中存在Fe-SOD与Mn-SOD。这两类酶的性质与构造，除金属离子不同外，颇为类似。在有氧条件下生长的大肠杆菌含有3种SOD同工酶，其中一种酶为Mn-SOD，另一种为Fe-SOD，而第三种酶却为1个Fe-SOD亚基和1个Mn-SOD亚基的杂交二聚体。无氧条件下生长的大肠杆菌仅含有Fe-SOD，但改在有氧条件下就含有上述的三种SOD同工酶。由此可见O2可促进Mn-SOD的生物合成。O2.-起到关键作用。据Moody等报道，在大肠杆菌中Fe（Ⅲ）的螯合剂可引发Mn-SOD的生物合成。他们认为Mn-SOD生物合成受到操纵子的负调节（见下图）。
....图1.4 O2.-与Fe2+和Mn-SOD的生物合成的关系
....真核生物的Mn-SOD的合成比较复杂。1990年Church从人胎盘cDNA文库克隆到一全长4.2kb的Mn-SOD cDNA[18]，其中3，-UTR长达3426bp。3，端还各有一个与SP1和NF-κB 一致的序列。这些潜在的调节元件的生物学功能目前正在研究之中。但SP1、AP2和NF-κB 一致序列的存在提示，这些潜在调节因素在人Mn-SOD基因表达调控中可能起着重要的作用。Mn-SOD的表达受到部分细胞因子的影响，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、脂多糖（LPS）均可诱导Mn-SOD mRNA的表达而转化生长因子-β（TGF-β）直接降低Mn-SOD的活性。文献报道，培养基中的单核细胞受细菌LPS刺激后3天，Mn-SOD 增加了4.7倍。Naoyuki等也报道，hMn-SOD在人卵巢癌中大量表达，说明癌细胞中存在一种刺激hMn-SOD表达的物质。
....此外，Mn-SOD的活性调节还与氧压有关，Mn-SOD只有当有氧气存在时才存在。因此，Hassan等人认为其作用机制可能是：（1）分子氧直接充当诱导剂或去阻遏剂；（2）分子氧还原成O2.-，然后作为诱导剂或去阻遏剂；（3）O2.-与一些前体反应，产生更稳定的产物，由其充当诱导悸或去阻遏剂。O2.-是一类很重要的氧毒性试剂而Mn-SOD对其毒性有十分重要的防御功能。
4. hMn-SOD的分子生物学研究进展
4.1 hMn-SOD的分子生物学特性
....Autor，Wisp等人[10， 13 ]报道Mn-SOD是一种位于膜内的线粒体基质酶，对于Mn-SOD 的生物合成所知甚少，目前只是知道它是由细胞核第6号染色体编码的，首先在细胞质内形成一个较大的前体形式，这个前体比成熟的多肽的分子量大2000—6000道尔顿，所合成的蛋白质必须通过线粒体内膜和外膜，这个过程需要能量以及线粒体基质中的一种特殊的线粒体蛋白酶参与，因此在含有大量线粒体的人组织中（如肝脏、心脏、肾脏）中Mn-SOD的含量都较高。成熟的蛋白由大约198个氨基酸残基组成，其前导肽约为24个氨基酸残基，所以Mn-SOD亚基大约由222个氨基酸残基组成。Church等于1992年[14]通过原位杂交和建立杂交图谱的方法确定hMn-SOD是一个由位于第6号染色体长臂2区5带（6q25）的由核基因
编码的抗氧化酶，有活性的Mn-SOD蛋白最后定位于线粒体基质。Mn-SOD基因的表达既可因细胞受到辐射、氧化或还原试剂、细胞因子、病毒感染等因素的刺激而显著提高，也可随细胞的癌变而大幅度降低[15~17]，表明Mn-SOD的诱导表达对机体防护氧胁迫具有重要作用。因此，Mn-SOD基因表达的应激性波动现象及与肿瘤发生的相关性，引起了人们对其基因结构研究的重视。
....目前已从cDNA3′端非编码区多样性、基因结构与调控序列特点等方面得到一些对人Mn-SOD基因表达规律的理解和线索。Nothern Blotting 实验显示，hMn-SOD 的转录有长约1kb和4kb的2种mRNA[18]。为探明不同转录子是否来自同一基因及其结构差异，自Beck 等首次从人T淋巴细胞克隆Mn-SOD cDNA[19]以来，不同作者又相继克隆了胎盘、肝脏、大肠癌细胞等不同组织或细胞来源的Mn-SOD cDNA，通过比较发现，不同组织或细胞来源的Mn-SOD cDNA中编码序列和5′端非翻译区基本一致，即具有高度同一性，但3′端非翻译区在长度和碱基序列上存在明显差异。
....Beck[19]等发现，人Mn-SOD cDNA包含666bp的编码区域，3′端为非翻译区域缺乏AATAAA的多聚腺苷酸信号。预测得到的氨基酸顺序见下图。
1 GCT GTG GTG GCT TCG GCA GCG GCT TCA GCA GAT CGG CGG CAT CAG CGG TAA GCC AGC ACT 61 AGC AGC ATG TTG AGC CGG GCA GTG TGC GGC ACC AGC AGG CAG CTG GCT CCG GCT TTG GGG M L S R A V C G T S R Q L A P A L G
121 TAT CTG GGC TCC AGG CAG AAG CAC AGC CTC CCC GAC CTG CCC TAC GAC TAC GGC GCC CTG -6 Y L G S R Q K H S L P D L P Y D Y G A L
181 GAA CCT CAC ATC AAC GCG CAG ATC ATG CAG CTG CAC CAC AGC AAG CAC CAC GCG GCC TAC 15 E P H I N A Q I M Q L H H S K H H A A P
241 GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT 35 V N N L N V T E E K Y Q E A L A K G D V
301 ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT 55 T A Q I A L Q P A L K F N G G G H I N H
361 AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA GGG GAG TTG CTG 75 S I F W T N L S P N G G G E P K G E L L
421 GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA 95 E A I K R D F G S F D K F K E K L T A A
481 TCT GTT GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG CAA CGG GGA CAC 115 S V G V Q G S G W G W L G F N K Q R G H
541 TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA 135 L Q I A A C P N Q D P L Q G T T G L I P
601 CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT 155 L L G I D V W E H A Y Y L Q Y K N V R P
661 GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAG ATG 175 D Y L K A I W N V I N W E N V T E R Y M
721 GCT TGC AAA AAG TAA ACC ACG ATC GTT ATG CTG ATC ATA CCC TAA TCA TCC CGA CAA GAT 195 A C K K
781 AAT GTC CTG TCT TCT AAG ATG TGC ATC AAG CCT GGG TAC ATA CTG AAA C
....1990年，Church从人胎盘cDNA文库克隆到一全长4.2kb的Mn-SOD cDNA，其3′端非翻译区长3426bp[18]。经过分析作者认为这一迄今所得最长的Mn-SOD cDNA大致可以涵盖其他组织或细胞来源的较短cDNA 。除加Poly（A）信号序列有所不同外，其3′端非翻译区上端193bp的碱基序列与Wispe等自大肠癌细胞克隆的1021bp的 Mn-SOD cDNA 3′端非翻译
区完全一致[20]，而上段19bp加下段36bp与Beck等自T淋巴细胞克隆的830bp Mn-SOD cDNA 3′端非翻译区序列相同[19]，并在上段19bp与下段36bp之间的相应位臵有可供完成mRNA 剪接反应的剪接供体（GT）和剪接受体（AT）序列。据此可以推测，Mn-SOD的较短mRNA系由较长mRNA剪接而来。值得注意的是，在Mn-SOD DNA 3′端非翻译区中段有一与某些细胞因子或癌基因类同的AT富集区，提示Mn-SOD基因的表达与细胞因子或癌基因有相似的应激性变化特征。
....1994年，Wan等获得了长达1285bp的hMn-SOD基因组DNA序列[21]，全序列分析表明，hMn-SOD是单拷贝基因，hMn-SOD基因组包含5 个外显子和4个内显子，转录起始部位上游的5′端序列仅长782bp，通过引物延伸实验，找到一个与众不同的转录起始位点（TIS）位于翻译起始点上游，也即第一外显子起始密码（ATG）上游74bp处。在转录起始部位的上游，有一长约400bp的区段，G+C含量高达78%，集中分布着7个SP-1（promoter-selective transcription factor-1，5′-GGGCGG-3′）和3个AP-2（activator protein-2，5′-CCGCGGGCG-3′）转录因子结合序列。但在5′端上至780bp的范围内未发现一般基因所常见的TATA和CAAT盒序列，除5′端有与AP-2和SP-1一致的序列外，3′端还各含有一个与SP-1和NF-κB一致的序列。这些潜在的调节元件的生物学功能目前尚在研究之中，但SP-1、AP-2和NF-κB一致序列的存在提示，这些潜在调节因素在hMn-SOD基因表达调控中可能起着重要作用。
....1996年，Zhang[22]等从人白细胞基因组文库中得到一个Mn-SOD基因组DNA序列，其5 ′端序列长5538bp，揭示hMn-SOD基因的启动子位于-200bp—-1bp之间，此序列的G+C 含量高达84%，在启动子区域含有8个Sp1结合位点。同时他们将Mn-SOD基因5′端上游序列连入CAT报告基因（pGCAT5538），并进行了HepG2、神经胚细胞瘤及皮肤纤维原细胞等细胞系检测功能的实验，结果发现：hMn-SOD基因表达受一个启动子控制，围绕转录起始部位的-114bp到+38bp区段（152bp）具有引导下游基因表达的最强活性，此区段中包含4个SP-1转录因子结合序列，应是hMn-SOD基因主要启动子的所在部位；-34bp到+38bp区段是RNA 聚合酶和转录起始因子的结合部位，是调控hMn-SOD基因启动子活性的主要转录因子；hMn-SOD基因启动子可被上游一个富含GC的DNA序列所激活，此序列含有3个Sp1结合位点（-114bp—+38bp），并且第一个Sp1结合位点（-18bp—-12bp）可能在hMn-SOD基因启动子的转录起始中起着重要作用。转录起始部位上游-2013bp到-223bp区段在肝癌细胞中引导基因表达的活性明显高于神经瘤细胞，而-717bp到-223bp区段在两种细胞中的表达活性相似，提示在-2013bp到-717bp区段内可能存在负调控序列，对Mn-SOD基因的组织或细胞特异性表达起重要作用。Zhang鉴定的转录起始部位与Wan等稍有不同，即转录起始部位位于第1外显子起始密码上游67bp处，并且在长达5.5kb的5 ′端上游序列中又发现了一些重要调控元件，如一个AP-1转录因子结合序列（5′-GTGACTTAA-3′），一个急性期反应序列（5′-CTGGGA-3′），及二个与Egr-1基因调控序列（5′-GCGGGGGCG-3′）相近序列（5′-GCGGGGCG-3′）等。特别值得一提的是Egr-1基因调控序列，Egr-1基因最初自血清因子刺激增殖的小鼠3T3细胞中克隆，后被证实是在细胞受到辐射作用早期被大量诱导表达的基因，Mn-SOD基因结构中存在与Egr-1基因类同的调控序列，是其具有辐射诱导特性的有力证据。此外还发现，hMn-SOD一个最显著的特征是在-1584bp到-1524bp之间有一个残留的人Alu 序列。
4.2 hMn-SOD基因的克隆与表达
....从研究现状来看，hMn-SOD基因工程的一些实验研究已经取得了可喜的成果。到目前为止，hMn-SOD基因已经在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物等系统中得到表达。
....1992年Taniguchi等将人红细胞中Mn-SOD在人卵巢癌中进行了表达，信号转导途径参与了Mn-SOD基因的表达，实验证明多种细胞因子如肿瘤致死因子（TNF）、脂多糖（LPS）、
白介素-1（IL-1）、佛波酯等都可诱导Mn-SOD mRNA的表达。Takahashi 等[23]将hMn-SOD 基因克隆于含tac-PL 杂合启动子的质粒，在大肠杆菌中获得表达，表达量为7.7×105u/L，而只含PL启动子的质粒，表达水平仅为2.1×105 U/L。Gorecki等[31]将hMn-SOD于大肠杆菌中表达，表达量为25%，相对分子质量为为22kd，在不加入金属离子的情况下，所表达的产物以不溶的包含体存在，而当在培养基中加入Mn2+后，则大部分可溶，产生有活性的包含体。1994年Fujii等[25]在杆状病毒/昆虫细胞系统中对hMn-SOD进行了表达，但是在传统的培养基中不显示酶活力，产生的是脱辅基酶蛋白，只有加入金属锰离子诱导才能充分激活Mn-SOD的活力，说明Mn2+ 对hMn-SOD的活力是必需的。此外，Mn2+还可增加线粒体中蛋白的积累量。因此认为Mn2+不仅参与活性中心的形成，而且与线粒体内酶的半衰期有关。Wright[26]将人Mn-SOD基因在昆虫sf9细胞中表达,表达量为15%-25%。
1995年骆训懿[27]等用逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）以人胎肝总RNA为模板，扩增了人hMn-SOD的cDNA片段，并将其克隆到载体pGEM—T中，对重组质粒进行了限制酶切分析和序列测定，得到含hMn-SOD cDNA的重组质粒，将此hMn-SOD cDNA重组到表达载体pBV220内，重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达hMn-SOD，表达产物占菌体总蛋白的14%。1999年，施惠娟等[28]用RT-PCR法，以人肝细胞株（LO2）总RNA为模板，扩增了人hMn-SOD的cDNA，重组到T7启动子控制下的表达载体pET-24α（+）中，构建了表达质粒pET-Mn-SOD，并转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L IPTG诱导，可高效表达一个相对分子质量为22 kd的蛋白质，表达量约为菌体总蛋白质的50%，酶比活为387.5U/mg。
5. hMn-SOD的临床应用
....目前国内外利用Mn-SOD治疗的病种有：氧中毒；恶性肿瘤；辐射损伤防护；抗炎作用等。虽然Mn-SOD是毒副作用很小的生物大分子，但作为抗原，多次注射体内仍可诱发免疫反应和过敏反应，而且其来源十分有限，故将Mn-SOD用作药物的最理想的方法是进行Mn-SOD 的基因克隆和表达。近年来，美、日、英、等国已相继开发了hMn-SOD基因工程产品，并进行了临床实验，日本三井东亚化学公司最早生产重组人Mn-SOD并将其用于治疗心肌梗塞后缺血再灌注的心肌保护剂。
....Gorecki等[24]比较了rhMn-SOD与rhCu/Zn-SOD在抗炎及抗辐射方面的临床应用，发现：rhCu/Zn-SOD的生物半衰期只有6-10min，而rhMn-SOD则为5-6h，因此rhMn-SOD在慢性病的治疗方面可能更加有效；通过建立这2种SOD在抗炎症及辐射损伤的动物模型，考察了其生化活性、药物动力学及治疗效果发现：由于rhMn-SOD的生物半衰期长，因此它更适于炎症的长效治疗；由于光诱导的损伤分2步进行：①新形成的活性氧自由基的直接损伤；②较慢的炎症涉及到中性白细胞增多浸润，在低照射剂量下，2种SOD均有效，而在高剂量下，只有rhMn-SOD才有效，这也说明在需较长时间的次级炎症治疗方面，rhMn-SOD也许更合适。炎症反应细胞因子可以诱导大鼠Mn-SOD mRNA的表达，研究表明重组Mn-SOD在保护小鼠黄体细胞免受由炎症反应介导的氧化损伤中具有重要的作用[29]。实验证明[30]，作为一种抗炎试剂，rhMn-SOD在治疗角叉菜诱导的小鼠脚掌水肿急性炎症具有很好的效果。利用重组Mn-SOD的抗炎效果治疗非特异性关节炎，每隔两天进行局部注射，可以明显改善脚掌的浮肿。但是研究表明只有适中剂量的rMn-SOD处理短时间才可以有效地抑制炎症反应，然而即使是低剂量的Mn-SOD处理48小时，也会使炎症反应发生恶化。相反，5mg的Mn-SOD处理24小时对膝关节肿胀有显著的抑制作用[31]。Yoshinaka等[32]对人胎儿肺细胞系MRC-5细胞进行用甲病毒和辛德毕斯病毒（SV）感染，发现在感染期间Mn-SOD发生了诱导表达，而且Mn-SOD 过量表达的SV感染的细胞中，有20%的细胞其存活期超过了1个月，而感染SV的细胞在48小时之后有99%已经死亡。
....孙娟等[33]最近研究发现，将有义Mn-SOD cDNA导入中国仓鼠卵巢（CHO）细胞不仅能降低该细胞克隆对大剂量电离辐射的敏感性，而且对小剂量电离辐射诱发的细胞凋亡也有明
显的阻断作用。反之，转染反义Mn-SOD cDNA的细胞克隆对大剂量电离辐射的损伤作用和小剂量电离辐射诱发的细胞凋亡作用的敏感性都升高。因电离辐射能诱导O2.-的产生而损伤细胞，Mn-SOD是清除O2.-作用的线粒体基质酶，因此认为Mn-SOD的抗辐射作用可能是通过清除电离辐射过程中产生的O2.-而发挥作用的。此外，转化人Mn-SOD基因的重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO）可以提高对百草枯的耐受性，那么在体外增加Mn-SOD基因的表达量就可以增强细胞对氧化剂损伤的保护作用[34]。因细胞因子如TNF、IL-1和IL-6都能选择性诱导Mn-SOD基因的表达，而不是Cu/Zn-SOD或其它抗氧化酶[35]，TNF和IL-1又都是近年来公认的具有辐射防护作用的细胞因子，由此认为，TNF和IL-1的辐射防护作用机制是通过特异性诱导Mn-SOD基因表达来实现的。可见，Mn-SOD基因表达的调控就在电离辐射防护作用中起着一定的作用。如IL-1在增加造血干细胞的辐射防护功能的同时，诱导了Mn-SOD基因的表达，这说明Mn-SOD对IL-1的防护功能有重要作用[36]。Taniguchi等[37]将hMn-SOD基因在人卵巢癌细胞中进行了高效表达，研究表明，肿瘤坏死因子、脂多糖、白介素-1和佛波酯不仅可以诱导Mn-SOD的mRNA，而且可以诱导其蛋白的表达。但是对于CuZn-SOD却不出现这种现象。诱导机制的研究表明信号转导途径参与了Mn-SOD基因的表达。其一是由蛋白激酶激活其自身而启动反应；另外一种途径是通过各种细胞因子的积累，其中佛波酯可以诱导蛋白因子。此外，注射高剂量的N+可以诱导Mn-SOD的活力[38]。
....另有研究发现，Mn-SOD基因转染细胞能够降低除草剂百草枯（paraquat）、TNF及叔丁基脂氢过氧化物（tbooH）等对细胞的毒性作用，而这些因素都可诱发ROS的产生。这些资料显示，Mn-SOD能够提高细胞对氧应激反应的耐受性。Epperly等[39]用基因治疗的方法将Mn-SOD用来治疗由于照射和电离辐射引起的肺损伤；在人肺部上皮细胞中，Mn-SOD的过量表达可以使放射后产生的细胞凋亡降低50%。这一发现可以使Mn-SOD用于放射损伤的基因治疗[40]。Liu等[41]发现通过增加Mn-SOD在目的细胞中的表达活性可以阻止或降低人口腔恶性肿瘤的发生，这是人口腔癌的基因治疗的一个例证。无论在体内还是在体外，Mn-SOD基因在乳腺癌细胞MCF-7中的过量表达，都可以抑制肿瘤细胞的生长。因为在Mn-SOD基因过量表达的同时，具有DNA结合活性的转录因子AP-1和NF-B被Mn-SOD基因抑制[42]。....最近，rhMn-SOD被更多的用于与疾病缺血再灌注损伤有关的治疗研究[43]。Mn-SOD可以降解局部缺血再灌注损伤中出现的超氧化物，Mn-SOD作为“垃圾清道夫”，在细胞受到损伤之前清除ROS潜在的毒性，而且它在整个器官的病理和炎症反应中可以激活信号转导的级联反应[44]。再灌注过程中静脉注射重组SOD可以显著改善肝细胞的微循环，同时可以降低白细胞粘连的百分比[45]。Mn-SOD与腺病毒重组在小鼠体内表达可以用来进行由氧化还原作用介导的基因治疗，改善缺血再灌注损伤和肝原位移植过程中的急性排斥反应[46]。重组的Mn-SOD还可以用于心脏直视手术过程中的缺血再灌注损伤[47]。重组的SOD还可以用于治疗组织缺氧[48]。Mn-SOD的过表达可以降低由腺病毒转化引起的AP-1（氧化还原作用敏感型的转录因子）的结合活性，从而对氧化还原作用进行调节[49]；在心肌细胞中，当有外部压力如缺氧、热击或肾上腺素积累的影响时，Mn-SOD可以被诱导表达。这种诱导表达与心肌的缺血再灌注损伤有密切关系。因为抑制Mn-SOD的活性会导致心肌丧失对缺血再灌注的耐受性，因此作为一种挽救蛋白，Mn-SOD在心肌细胞中起着关键的作用，也许Mn-SOD的诱导表达可能是对于局部缺血的心脏疾病的一种适应机制[50]。
....此外小鼠中转Mn-SOD基因可以降低抗肿瘤试剂阿霉素诱导的急性心脏毒性，因为阿霉素杂作用过程中会产生超氧阴离子自由基O2.-[51]。另外无论是体内还是体外实验，肿瘤细胞转染人Mn-SOD cDNA后在放疗时可以降低放射剂量[52]。
....总之，Mn-SOD无论是剂型、用药途径还是临床应用范围都是相当广泛的，是一种具有广阔前景的蛋白多肽类药物，其药用领域潜力很大。由于其他动植物及微生物来源的Mn-SOD 其安全性和耐受性越来越受到人们的重视，人们渐渐将注意力集中到hMn-SOD基因工程方面
来，因此积极开展hMn-SOD基因工程及其下游技术的研究意义重大，特别是为了赶超世界先进水平，立足国内发展生物工程药物，我们更不能放弃这方面的努力，争取尽快将我国的hMn-SOD基因工程及其药物生物技术的研究提高到一个新的领域。
随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。
迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。
1 启动子克隆的几种方法
1.1 利用启动子探针载体筛选启动子
启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。
利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位臵；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始MM子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。
最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。
1.2 利用PCR技术克隆启动子
即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。
苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5'启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5'启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI 和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp，含有SD序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。
上述的PCR方法简便、快捷、操作简单，是人们较为广泛使用的技术。
1.3 环状PCR
环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。
1.3.1 I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA 片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物(流程如图1所示)。
韩志勇等以I-PCR技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。先用小量法提取转基因水稻的总DNA，总DNA用10倍过量的限制内切酶进行过夜酶切，酶切片段进行自连接，然后根据工程质粒的T-DNA区设计2对反向引物，进行套式PCR扩增旁侧序列。建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。在1周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300～750bp之间。I-PCR法快速、高效、稳定，操作相对简单，花费少，PCR引物设计比较方便。
1.3.2 P-PCR P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5'或3'粘末端，然后连接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列(流程如图2所示)。黄君健等成功地应用P-PCR技术从正常的人外周血单核细胞基因组DNA中扩增端粒催化亚基hTERT基因5'端上游旁侧序列，获得了hTERT基因翻译启始位点上游2090bp的基因组DNA 序列。首先用酶切消化基因组DNA，得到带有GATC的5'突出端的DNA片段。然后利用已知的hTERTcDNA序列设计PCR引物，用常规的PCR方法扩增出1条大约900bp的基因组特异片段，序列分析为hTERT的基因组DNA片段。根据得到的基因组DNA序列的信息，确定P-PCR 的引物退火区，并合成了5'磷酸化的连接寡核苷酸和4条基因特异性引物，其中连接寡核苷酸5'端的4个碱基CTAG与上述核酸内切酶消化产生的5'突出端GATC互补，然后将连接寡核苷酸与基因组酶切产物连接，以连接产物为反应模板，进行PCR，使模板自身进行退火-延伸反应，以形成Panhandle结构。最后以单链Panhandle为模板，4条基因特异序列为引物进行嵌套式PCR，最终获得了1条约2kb的含hTERT基因启动子的DNA片段。Jones等利用改进的P-PCR，在形成panhandle结构之前3'末端连上ddCTP，使引物错配的机率减少，特异性增加。他们从人类基因组DNA已知位点侧翼扩增了4～9kb的大片段未知序列。P-PCR 是目前能够扩增距已知序列最远的未知DNA序列的方法，有很高的特异性。
1.4 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子
这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。
1.4.1 利用载体的PCR Shyamala等利用的单特异性引物PCR(SSP-PCR)对以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步行。以M13mpl8RF DNA为载体。用PstI和AraI酶切基因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增，由于非特异片段没有单特异引物结合
酵母双杂(共转)
酵母双杂交的原理及实验步骤 吴健2015.12.25 一酵母双杂交的原理 在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1 的转录。GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结 合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在 重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。酵母双杂交系统就是在 这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。除了 将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。 Fig1. 酵母双杂原理图
Fig2. 常用两种酵母菌的基因型 Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因
Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图
二酵母双杂交的基本步骤 1 酵母感受态的制备 配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。 1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌 落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种； 2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的 YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h； 3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震 荡培养20 h，直到OD 600 =0.3； 4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5； 5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块； 6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块； 7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec； 8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。制好的 感受态细胞应该立即使用（2 h 以内），不能长时间保存。 2 酵母小规模转化 2) 在预冷无菌的1.5 ml 的离心管中依次加入： 质粒DNA 0.5 μg herring testes carrier DNA（10mg/ml） 5 μl （使用前沸水煮5min，立刻放入冰上）感受态细胞50 μl 轻轻震荡混匀； 3) 加入0.5 ml 的PEG/LiAc 溶液，轻轻在振荡器上震荡混匀； 4) 在30℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 混匀一次； 5) 加入20 μl 的DMSO（Dimethyl sulfoxide），42℃水浴热休克15 min，每隔5 min 混 匀一次； 6) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml YPD plus 液体培养基悬浮细胞块； 7) 30℃震荡培养90 min； 8) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml 的0.9%的NaCl 溶液悬浮； 9) 取1:10, 1:100, 1:1000 的稀释度涂皿；或者直接取100 μl涂于相应的SD平板上， 10) 30℃倒置培养直到单克隆长出，统计转化效率。挑取单克隆检测以及保存菌种， 备用。
酵母双杂交系统原理的应用
酵母双杂交系统原理的应用 1. 什么是酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。这个系统利用酵母细胞中的转录因子和报告基因来实现。当两个蛋白质相互作用时，可以触发报告基因的表达，从而显示出它们之间的相互作用。 2. 酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统的原理主要基于透明质酸选择活化子（activation domain）和DNA 结合结构域（DNA-binding domain）相互作用。这种相互作用会激活基因的表达，从而触发报告基因的产生。酵母细胞中通常包含两个重要的部分：转录因子DNA 结合结构域（DBD）和活化因子 DNA 结合结构域（AD）。 •转录因子 DNA 结合结构域（DBD）：该结构域能够识别和结合目标DNA序列，从而调控基因的转录。 •活化因子 DNA 结合结构域（AD）：该结构域能够激活特定的报告基因的表达。 当两个蛋白质相互作用时，将目标蛋白质的DBD域与AD域融合到一个融合蛋白中。当这个融合蛋白与另一个蛋白质结合时，就会形成一个激活结构，从而使报告基因得以表达。 3. 酵母双杂交系统的应用 酵母双杂交系统在生物学研究中应用广泛。以下列举了一些常见的应用领域： 3.1. 蛋白质-蛋白质相互作用的研究 利用酵母双杂交系统，研究人员可以快速筛选并确认蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。通过构建大规模的蛋白质库，可以鉴定出蛋白质与蛋白质之间的相互作用网络。这有助于理解蛋白质相互作用对于细胞的功能和调控的作用。 3.2. 蛋白质-小分子相互作用的筛选 酵母双杂交系统也可以用于筛选蛋白质与小分子之间的相互作用。研究人员可以将小分子与AD结构域融合，并与目标蛋白质库进行酵母双杂交筛选。这有助于发现新的药物靶点，并加速新药的开发过程。
酵母双杂交原理、操作方法
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的
酵母双杂交的一些问题
研究蛋白互作的方法 蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧 常用的体外互作研究方法： 1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h) 酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 ⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。 “假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。 “假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。 体内互作的研究 1、荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的
酵母双杂交系统及其应用
酵母双杂交系统及其应用 Yeast Two-hybrid System and Its Application 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 germinate，v.发芽, 发育, 使生长 spore，n.孢子vi. 长孢子
酵母双杂交系统的发展和应用
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
LexA酵母双杂交系统简介
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。 在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3.大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4.对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)假阳性检测质粒 5.引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1.将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2.同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3.构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4.将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明 (含有Gal/Raf) pLexA-Pos SD/-His，-Ura蓝阳性对照 pLexA SD/-His，-Ura白阴性对照 PlexA-X SD/-His，-Ura白没有直接激活活性
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理 酵母双杂交（Y2H）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术。它基于酵母细胞内所含的转录因子结合区域分开的与激活区域结合的能力的原理而发展出来。 当把转录因子分成两个区域，一个称为DBD（DNA binding domain），另一个称为AD（activation domain），并使它们相互独立地与相应的配体结合时，它们就可以进行有效的转录激活。通常来说，DBD和AD都不具有激活作用，但它们可以相互结合并发挥起激活作用。因此，当DBD与某一DNA序列结合时，如果另一配体结合于AD，则该复合体就可以被转录激活。 基于这个原理，Y2H技术使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验系统进行实验。它使用了两个重要的质粒：一个称为“鱼钩”质粒（bait plasmid），它含有DBD和一个感兴趣的基因的DNA序列；另一个称为“猎物”质粒（prey plasmid），它含有AD和另一感兴趣的基因的DNA序列。这两个质粒分别要被转化到两个不同的酿酒酵母分别作为它们的基因组。 当两个酵母的基因组都被转化后，它们被分别引入到含有选择性培养基的平板中去。在这些平板上，只有那些同时表达了成功酯化的双杂交融合DBD和AD的细胞才能成
长起来。因此，这个实验系统几乎可以保证筛选到高亲合力的蛋白质因子。 值得注意的是，由于酿酒酵母是真核生物，与含有DBD和AD的两个质粒的匹配也是在真核生物级别上完成的，而不是简单的受体和配体之间的作用。因此，这种技术可以很好地模拟在真核生物细胞内发生的相互作用。 Y2H技术不仅可以用于蛋白质因子的筛选，也可以用于检测DNA的相互作用。例如，在要求蛋白质－DNA相互作用的特定细胞系上建立的实验系统中，可以使用这种技术来筛选那些与基因诱导子结合的转录因子。因此，该技术可用于分析人类疾病中蛋白质相互作用的发生机制。 总的来说，酵母双杂交技术是一种强大而有效的分子生物学工具，可以用于研究蛋白质之间的相互作用以及转录机制。它不仅可以被用于大规模的筛选，还可以在分子水平上模拟真核生物细胞内的相互作用。在以后的研究中，这种技术还将发挥更广泛的作用，因此我们对它的进一步研究依然很有必要。
酵母双杂总结
酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交的作用
酵母双杂交系统 酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和 Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map） 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析
酵母双杂的原理
酵母双杂的原理 酵母双杂也被称为酵母双杂交试验，是一种常见的遗传分析技术。它基于酵母细胞在特定条件下能够进行性状表达的能力，通过将两个不同的酵母株杂交，观察它们的后代表现出的特定性状，从而了解这些性状背后的遗传变化。酵母双杂的原理涉及到多个因素，下面我们将详细探讨其中的几个主要方面。 1. 酵母细胞的基本生物学特性 酵母细胞是一种单细胞真菌，相对于高等生物细胞而言，其体积和基因组相对较小，生长周期较短，生命周期较为简单和轻松。因此，酵母细胞成为了分子生物学研究中常用的模型生物之一。酵母细胞对环境变化的反应能力强，可以在不同的温度、pH值、营养物质等条件下进行生长，从而满足生命活动的需要。 2. 酵母表达系统的构建与优化 为了利用酵母细胞进行遗传分析，必须建立切实有效的表达系统来实现基因的外源表达和功能研究。酵母表达系统的优点在于其操作简单、易于维护和扩展。酵母表达系统的核心构建是将外来DNA片段嵌入酵母基因组中，通过编码之后的蛋白质在细胞内部进行活动，影响表现出来的生物学特性。通过不断地对酵母表达系统的构建与优
化，可以有效提高其操作性能，为酵母双杂交实验的开展提供了坚实的基础。 3. 酵母杂交的过程与特点 酵母双杂交的基本特征是将外源DNA片段插入到不同酵母株的染色体中，使得它们进一步控制性状表达。在杂交前，需要先将一段特定的序列嵌入到外源DNA片段中，以使其呈现可检测的表型。一旦杂交成功，杂交株会承担多种不同的表型。这些表型如何传递到后代，和直接交叉和突变等因素有关。通过对后代的不断筛选，可以获得对基因的分离，解释各种表型的利器。 4. 酵母双杂的应用 酵母双杂的应用范围非常广泛。在科学研究领域，它被用于鉴定基因与相互作用网络的建立，为基因组学、蛋白质组学等学科提供了重要工具。同时，在制药、食品安全等产业领域也有着广泛的应用，酵母双杂可以用于筛选候选药物靶点，也可以用于检测食品中的致病微生物和有害物质。 综上所述，酵母双杂交试验是一种基于酵母细胞表现出性状变化的遗传分析技术。其实现与优化需要考虑到酵母细胞的基本生物学特点和表达系统，了解酵母杂交的特点和应用场景，并不断地探索和完善其操作流程，从而为科学研究和实际应用带来更多的价值。
酵母双杂的原理及应用
酵母双杂（Hybrid Yeast）的原理及应用 1. 引言 酵母是一类单细胞真菌，广泛应用于食品、药品和酿造等领域。酵母双杂（Hybrid Yeast）是利用不同类型的酵母进行交配培育出的一种新型酵母。本文将从酵母双杂的原理和应用两个方面进行介绍。 2. 酵母双杂的原理 酵母双杂是通过将两个不同的酵母菌株进行交配，融合不同的基因组合来实现的。酵母双杂的原理主要包括以下几个步骤： •菌株选择：选择两个质态互补的酵母菌株作为双杂交配的材料，通常选择具有不同性别的菌株，如雄性和雌性，以增加交配概率。 •受精：将选定的酵母菌株分别培养在含有营养物质的培养基上，培养基中的营养物质可以刺激菌株的生长和繁殖。通过培养，使酵母菌株达到一定的生长周期后，将雄性酵母菌株的细胞液与雌性酵母菌株的细胞液混合，实现受精。 •融合：经过受精后的酵母菌株会发生细胞融合，合并两个菌株的基因组，形成新的酵母双杂。 •筛选：对融合后的酵母双杂进行筛选，通过培养基中添加相应药物来筛选能够生长和繁殖的酵母双杂，去除无法存活的酵母菌株。 •稳定化：经过筛选后，将生长良好并符合要求的酵母双杂进行稳定化处理，使其具有较稳定的遗传特性。 3. 酵母双杂的应用 酵母双杂在许多领域中都有广泛的应用。以下是酵母双杂的几个应用方面：•食品工业：酵母双杂可以用于酵母发酵食品的生产，如面包、啤酒和酸奶等。通过融合不同的酵母菌株，可以增加食品的品种和口感。 •药品生产：酵母双杂在药品生产中起到重要的作用。利用酵母双杂可以合成多种药物原料，如抗生素、维生素和氨基酸等。通过优化菌株的基因组合，可以提高药品生产的效率和产量。 •酿造业：酵母双杂在酿酒过程中起到关键作用。不同的酵母菌株具有不同的发酵特性，通过酵母双杂可以培育出更适合酿酒的菌株，提高酿酒的质量和口感。
(完整版)酵母双杂交原理
(完整版)酵母双杂交 原理 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast?Two-hybrid?System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB， BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵
x-α-gal 产品说明
详细信息： X-α-Gal X-α-Gal是一种酵母半乳糖苷酶(MEL1)的显色底物，用于在培养基上直接检测GAL4系统的酵母双杂交作用。通过蓝白颜色筛选，快速和简便地识别阳性的蓝色克隆，无需费时的β-半乳糖苷酶报告基因检测。 X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活，MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因，编码分泌型的α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色产物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。 用途： （1）α-半乳糖苷酶的显色底物，形成蓝色沉淀。在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用，利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays； （2）用于区分肠杆菌科内的不同菌种以及区分双歧杆菌和乳酸菌； （3）在组织化学中用于酶活性的检测； 储存液的配制及使用步骤： A）涂布于预制平板： 溶解24mg X-α-gal于6 mL DMF，终浓度为4mg/ mL的溶液。 ①涂布200ul(15cm)或者100ul（10cm）X-α-gal储存液于预制平板上； ②放于37℃培养箱至液体被吸收（由于DMF挥发性低，最长可放4小时）； ③将转化细菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培养直至蓝色菌落出现。 B）直接加入xx中：
溶解60mg X-α-gal于3 mL DMF，终浓度为20mg/ mL的溶液。 ①将已灭菌琼脂培养基冷却至50-55 ℃； ②往已冷却的培养基中直接加入2 ml -10 ml 20 mg/ ml X-α-Gal储存液，混匀，快速倒平板。 外观： 白色或灰白色结晶粉末，或者无色结晶； 溶解度（1%甲醇溶液）： 无色，清澈； 储存： -15°C避光避潮保存；