彗星实验

彗星实验

彗星实验

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。

实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA 受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。实验材料：

玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。

实验步骤：

1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片

滑面及四周吸干，自然晾干备用；

2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5

细胞/ml悬浮细胞；

3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察细

胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min；

4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min;

5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上的

液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min;

6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。

7.漂洗及染色：电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2次，每次15min,以中和强碱。滴加

DAPI染色，立即置于荧光显微镜下观察。

结果观察：

荧光显微镜下20倍波长，激发波长377nm，发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=（拖尾细胞数/50）*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（TL）=全长-头长，计算各剂量组的平均尾长。

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ChIP具体操作流程

具体操作流程： 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul 含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于-80oC。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入 4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。 10、1h后，在4摄氏度静置10min沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。

CHIP技术

染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍 染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍 (Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP) (Abcam 公司与Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品) 染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 真核生物细胞状态就是由内源与外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都就是DNA。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质,染色质就是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子与辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域与羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制与调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。 染色质免疫沉淀分析(ChiP)就是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理就是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白,就是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP 与其她方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP 与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP 的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)就是目前研究转录调控蛋白与相应核苷酸序列

彗星实验

应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法 山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006)　孟紫强 中国辐射防护研究院二所　张连珍 提　要　对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。 关键词　慧星试验　单细胞微凝脉电泳　DNA损伤　哺乳类细胞　淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。但在我国有关研究报道甚少。为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。 1　SCGE测定原理 哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。 我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5～30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。 2　SCGE实验方法 211　细胞分离和处理　(1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015～1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。 212　制片　(1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻

CHIP实验操作

ChIP实验操作指南 国家瓜果改良中心荔枝分中心 采用Bowler等（2005）的方法，具体如下： 1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。 2加40 ml超纯水于离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2次。 3去掉尽可能多的水，再加入37ml 1% 甲醛，与15-25 ℃，真空放置15 min。 4 加入2. 5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M，再真空放置5 min。 5 加40ml超纯水与离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。 6去掉尽可能多的水，液氮速冻后-80℃保存或直接利用。 第一天 1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3，并4 ℃预冷。 2 液氮淹没样品，样品尽量磨碎，注意不用潮解样品。 3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ，再将样品粉末加入离心管中，轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min. 4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷，用两层滤膜将样品过滤入该离心管，如果滤液中仍有残渣，重复步骤4。 5 4 ℃， 3000g 离心10min。 6 小心弃上清，加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀，移入进口（或严格灭菌）的1.5ml 离心管，4 ℃，12000g离心溶液10Min. 7 小心弃上清，加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀，但要避免起泡。（核酸提取液3很粘稠，但还是要尽量重悬浮好沉淀）。 8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3，再将步骤7的溶液小心加入上层，4 ℃，16000g离心溶液1h（准备步骤9，制一块1%琼脂糖凝胶，用80μl CHIP 洗液洗磁珠）。 9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。 10 小心弃上清，加入300μl预冷核酸裂解液，于冰上用（剪过尖端）枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀，但要注意避免起泡。并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。 11 超声波破损染色质5次，每次15s，中间间隔1 min 避免溶液过热，避免损失过多及起泡。跑电泳（1%琼脂糖凝胶）检测超生效果（应该在200-1000bp之间）。可以把破碎后的染色质-80 ℃保存或直接进入下一步。 12 超声波破碎后溶液4 ℃，12000g离心5 min，上清液移至1个5ml离心管中，并移出10μl来，于-20℃保存作为“Input DNA对照”。 13 先验证这时候的超声波破碎后溶液体积少于300μl，再补加CHIP洗液至总体积3 ml。

毒性试验整理

实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。

彗星试验步骤

彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全

ChIP操作步骤

ChIP实验步骤 第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎 1. 交联前的准备工作 （1）细胞准备：对细胞进行一定条件的处理，以确保目的基因的转录激活。细胞密度应达到1×106细胞/10 cm培养皿。 （2）配制1％甲醛溶液：270 μl 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可，应使用高质量的甲醛。 2. 交联与超声破碎 优化超声条件，以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp～1000 bp的片段，具体操作如下（以HepG2细胞为例）： （1）小心吸出细胞培养液，加入1％甲醛溶液10 ml，37℃孵育10 min，然后置冰上5 min终止固定。 （2）小心尽量吸净培养液，用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。 （3）加入预冷的内含PMSF（10ul）的PBS 1 ml。刮取细胞并移至离心管中，于4℃以1200 rpm（约3000 g）离心5 min，小心移走上清液，得到细胞沉淀（细胞沉淀可于-80℃保存数月） （4）以200μl SDS裂解缓冲液重悬细胞（含PMSF：2ul），冰上放置10 min （5）冰上超声剪切染色质DNA，使其成为200 bp～1000 bp的片段（10个脉冲，每个20 s，脉冲间隔20 s） （6）加入5M Nacl 8 μl，65℃，4h至过夜，以解交联 （7）琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果（所获超声剪切物可于-80℃保存数月）。 第二部分、免疫共沉淀 如果超声条件优化已经优化好，在步骤“（一）.2(5)”后，进行下列步骤。对于阴性对照，采用下述步骤“5”所述。 接上述2(6) 1. 4 ℃，13,000rpm离心10min，转移上清至2ml离心管中。 2.以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800μl，稀释200μl的上清至2ml。 3.为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子，加入75 μl蛋白A/鲑鱼精DNA 琼脂, 4℃旋转孵育30 min。 4.4℃,以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂，将上清转移至新的离心管中。并从 这2ml中取出20μl作为“input DNA”对照。 5.将上清分为两份，一份加入针对DNA结合蛋白的特异性抗体2μg，另一份加 强如抗体阴性对照（IgG）2μg，4℃旋转孵育过夜（孵育时间可视情况而调整）。 6.加入60μl蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4℃旋转孵育60 min以收集抗体/转录因子 复合体。 7.4℃,以1000 rpm离心1 min，小心移除上清（内含未结合及非特异DNA）。 8.按以下顺序洗涤蛋白A/抗体/转录因子/DNA复合物，每种缓冲液加0.5ml，旋

彗星实验要点

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮， 用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道 您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时 3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看 https://www.wendangku.net/doc/551437948.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0 5、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。 其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影 响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。 结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，

彗星电泳方法整理

Comet assay简介 单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。 是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。 SCGE技术的原理： 细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。 随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。 依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。因此，研究人员渴望开发出一种专

ChIP 原理及实验方法

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法 实验原理 染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。 仪器和试剂

真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M甘氨酸，ddH O，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)， 2 蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇, 提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME； 0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、 Antipain、TPCK、Benzamidine） 提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2； 1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl ；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 2 核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） 洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配） 低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0

药物毒理学考试要点

名词解释 1.血脑屏障：是指血液-脑组织间液和血液-脑脊液间的屏障，由血液-脑屏障、脑脊液-脑屏 障和血液-脑脊液屏障三个屏障构成。 2.内分泌系统：是一种整合性的调节机制，通过分泌特殊的化学物质来实现对有机体的控 制与调节。 3.药物依赖性：也称药物成瘾性，是精神活性物质与机体长期相互作用下造成的一种精神 状态（有时也包括身体状态），表现为强制性地连续不断地使用该药物的行为和其他反应，目的是去感受该药物所产生欣快性精神效应，或是为了避免由于停用该药物引发的戒断症状所带来的严重不适感。 4.直接致癌物：指进入机体后不需经代谢活化，直接与细胞生物大分子（DNA、RNA、蛋 白质）作用而诱发细胞癌变的化学物质。 5.间接致癌物：指进入机体后需经细胞内微粒体混合功能氧化酶系统等代谢活化后才具有 致癌性的化学物质。 6.促癌物：此类物质本身并无致癌性，严格的说不属于致癌物，但它可以与致癌物协同作 用，诱发突变细胞克隆扩增，促进癌的发生；或在致癌物作用之后，反复作用与细胞，加速癌细胞发展成为癌瘤。 7.促癌剂：具有促癌作用的物质，通过促进突变细胞的克隆扩增而发挥致癌作用。 8.前致癌物：未经代谢活化的间接致癌物称为前致癌物或原致癌物。 9.辅致癌物：有些化学物质既非引发剂，也非促长剂，本身并不致癌，但能增强引发剂和 促长剂的作用，即能加速致癌作用的过程。 10.药物的暴露：通过对暴露、时间依赖性的靶器官剂量与毒性作用关系研究解释毒性作用

机制。 11.急性毒性试验：又称单次给药毒性试验，系研究实验动物一次或24小时内多次给予受 试物后一定时间内所产生的毒性反应，观察期至少为14天。 最大耐受剂量（浓度）：（MTD）指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。 最小致死剂量（浓度）：（MLD）引起个别受试动物出现死亡的剂量 LD50：（半数致死量）预期引起50%动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。 12.长期毒性实验：又称重复给药毒性试验，是研究实验动物重复给予较大剂量的受试物后 产生的毒性反应特征，药物非临床安全性评价的重要内容。 13.一般生殖毒性实验：在雌雄动物交配前的交配期直至胚胎着床给药，评价受试药物对动 物生殖的毒性干扰作用，即生殖过程的第一阶段试验。 14.致畸敏感期毒性试验：妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合阶段给药，评价受试药物对妊娠 动物、胚胎及胎仔发育的影响。致畸敏感期毒性试验即生殖过程的第二阶段试验。15.围生期毒性试验：从胚胎着床到幼仔断奶这段时期给药，检测受试药物对妊娠及哺乳动 物、胚胎发育以及子代出生后生长发育的不良影响。围生期毒性试验即生殖过程的第三阶段试验 16.光敏反应：指皮肤对光线敏感产生的不良反应，是由某些药物（化学药物）与皮肤接触、 经特定波长的光照后引起的皮肤损伤。 17.靶点：医学上进行某些放射治疗时，放射线从不同方位照射，汇集病变部位，这个病变 部位叫做靶点。 18.靶部位：药物吸收进入机体分布于全身，通常仅对其中某些部位造成损害，被药物造成 损害的部位叫靶部位。

ChIP实验的原理与实践

一、原理 转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在 基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转录是必需的，但不是充分的，通常需要一些特异的转 录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平，ChIP主要用于研究转录因子（个人 认为主要是特异转录因子的作用，因为这些因子的表达才有时空特异性）与下游基因的结合，如果 ChIP发现转录因子能与目的基因结合，那么这说明该基因可能是其下游基因，要想进一步证明，还要 做高低表达和荧光素酶等实验。 二、目的基因的筛选 1，如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了，理论上芯片会分析出样本中该转录因 子所有的下游基因，我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。 2、如果是做普通的ChIP，那么在实验前要进行初步的筛选，选择自己感兴趣的目的基因，设计 PCR引物，进行验证，所以，这样考虑的话，ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为，筛选目 的基因的方法有一下几种：a，查文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能

相关。b， 你的课题设计中涉及到的基因，比如说你课题中设计到c-myb基因，你就想看一下转录因子和c-myb的 关系（这个纯属碰运气）。c，根据自己早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录 因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因。 3、另外筛选完自己感兴趣的基因后，可以用一些分析工具进行初步的预测，这个网上也可以搜 到，就不罗嗦了，如果有战友需要，可以再讨论。 三、实验设计 这里只说说实验各组的作用 1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声 效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和 input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之 ，说明效率低，实验条件有待改进） 2、阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录

彗星实验

彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA 量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 实验材料： 玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。 实验步骤： 1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻 片滑面及四周吸干，自然晾干备用； 2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5 细胞/ml悬浮细胞；

3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察 细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min； 4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min; 5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上 的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min; 6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。 7.漂洗及染色：电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2次，每次15min,以中和强碱。滴加 DAPI染色，立即置于荧光显微镜下观察。 结果观察： 荧光显微镜下20倍波长，激发波长377nm，发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=（拖尾细胞数/50）*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（TL）=全长-头长，计算各剂量组的平均尾长。

彗星实验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。 1 材料与方法 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。 实验分组及UV处理 收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's 调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。 细胞活性检测台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。 彗星实验1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验，我们对该实验流程进行改良，首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，中和完成后

CHIP全解析

ChIP实验步骤 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl 终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。 10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。 取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 第二天： （一）、免疫复合物的沉淀及清洗。 12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。 4度颠转2h。 13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。 洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash b. high salt wash buffer-----one wash c. LiCl wash buffer------one wash

ChIP实验步骤-英文原版chip技术

一、ChIP实验步骤 第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul 含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl 终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。 10、1h后，在4度静置10min 沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。 取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。 12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。 4度颠转2h。 13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash b. high salt wash buffer-----one wash c. LiCl wash buffer------one wash d. TE buffer------two wash 15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。 每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。 16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：（一）、DNA样品的回收 17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。 18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。 45度处理2h。 19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。（二）、PCR分析二、技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状