用探针法进行基因分型的方法
用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原
癌基因进行基因分型
RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA 染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。
多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。
之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外，不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制，RET外显子测序保持黄金标准。
测序是一种耗时且昂贵的开管实验，需要生成PCR产物之后的额外操作。相反，高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验，不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之
内的序列变化。对检测PCR扩增子内杂合点突变的高分辨率熔解技术的系统研究发现，检测400bp之内的扩增子的敏感性和特异性是100%。最近，我们证实用高分辨率熔解分析进行RET 外显子突变扫描。虽然这种方法在盲实验中检测100%的突变，但是有些罕见的突变的熔解曲线相似，完全进行基因分型是困难的，在这种情况下，在最初的突变扫描之后需要测序。另一种方法，添加杂交探针可以分出RET突变的绝大多数的基因型，而不需要测序。
荧光标记杂交探针分析是一种快速、闭管操作的实验，可以通过探针/等位基因的熔解温度基因分型序列变化，但是需要昂贵的寡核苷酸修饰。非标记探针也可以通过Tm的不同进行基因分型，也是一种闭管操作的实验，需要LC Green染料。因为用DNA饱和染料检测，非标记探针和扩增数据可以从一个熔解曲线分析。Zhou等最近证实非标记探针基因分型分析可以补充突变扫描。但是，在同一个外显子之内的RET所有突变不能只用一条探针进行基因分型，因为探针下特定突变的熔解温度相似或相同。
为了完成闭管基因分型实验，发明了两步RET基因分型方法，此方法比测序技术成本低，耗时少。用于扩增熔解的第一个PCR阶段（主要实验），扫描RET外显子的序列变化，反之，非标记探针分析位于突变范围内，且分辨可能的基因型。第二个PCR阶段（第二次实验）需要限定数目的特定突变的探针对>50的RET序列突变进行明确的基因分型。用遮蔽技术设计的探针简化了突变分离。当探针下有多重的可能的序列突变使分析变得复杂时，遮蔽技术简化了探针熔解的判断。在多态位点选择含有错配的（缺失、不匹配碱基或一般碱基）可以遮蔽的序列变化。这样的话就在遮蔽多态位点人为的创造了一个与可能的等位基因的错配。野生型与遮蔽突变的等位基因都有一个与探针错配的碱基和相似的Tm。然而，突变等位基因在探针下其它的位置有一个额外的错配，可以通过比仅在遮蔽位置变化的等位基因稍低的Tm值鉴定。材料和方法
样品
此报道中用到的野生型RET基因的DNA基因组样品或有RET序列变化的样品在以前描述过。RET基因序列变化改变RET蛋白的功能引发MEN2综合症的是突变，然而RET序列改变不会引发MEN2综合症是多态。不能确定意义的稀有的或不会引起MEN2综合症的RET基因序列变化成为“序列变化”。在这份报告中，通过密码子数列出RET序列变化，野生型编码DNA序列后面是编码序列改变，伴随着加粗突变核苷酸（例：618（TGC→T A C）），反之多
态及序列变化用下划线标出。所有测试的RET序列变化的样品均有单个核苷酸改变，并且是杂合的除非有另外的阐明。RET突变基因型和多态性及序列变化基因型列于表1。
引物和探针
用完整DNA技术合成寡核苷酸。用Primer3设计引物。选择引物和探针检测所有已知RET突变，不包括分析中的普通多态（表2）。非标记探针包含有3’磷酸化或3’氨基修饰（整合DNA技术），避免PCR反应中的延伸。设计的探针用于分析每个外显子的突变热点。
RET基因分型实验中用了4种非标记探针（表2）：野生型（WT）探针，特定突变（MS）探针，只遮蔽单一多态核苷酸的遮蔽探针，遮蔽3个多态核苷酸的位置探针（一个密码子）。比如说，外显子13遮蔽探针（遮蔽1bp 769）在多态核苷酸位置有单个碱基的缺失。（WT13探针的“T”位置，表2）。外显子10和11位置探针与野生探针序列相比有3个核苷酸缺失，遮蔽一个致病密码子分辨密码子突变的位置。外显子10和11在致病密码子位置有同样的序列改变。比如说：外显子10，MS618/620T A C探针在密码子618-620有T A C序列，如表2描述。
PCR
用之前描述的不对称快速PCR扩增样品DNA，除了用表2中给出的引物浓度反应55个循环。外显子14反应包括2个探针，0.5μmol/L的WT14A探针和0.25μmol/L的WT14B探针。在主要实验和第二次实验一个野生型对照与每个探针一起参加反应。外显子13， WT13主要的实验反应用2个额外的对照：杂合和纯合密码子769样品。外显子10主要实验反应用620（TGC→A GC）突变样品作为正对照。
高分辨率熔解
在高分辨率熔解仪器HR-1（爱荷华科技，盐湖城，犹他州）上进行分析，将LightCycle 毛细管加入HR-1中，0.3℃/s加热。主要的实验中，RET外显子的扩增及非标记探针熔解数据从60℃到95℃采集。主要实验分析了每个外显子的扩增子及探针数据，除了外显子14。因为
*序列变化是杂合的除非在文本上另作说明。密码子DNA序列列出核苷酸改变，加粗突变且多态性或序列变化使加下划线的。·，可用的RET序列变化样品。
?未知意义的稀有序列变化或不引发MEN2综合症；查看参考文献。在RET致病密码子范围内密码子609或611的3个突变体与MEN2综合症没有联系。密码子922和852的突变体以前在MTC病人上发现过，也许不会引发MEN2综合症。
?良性多态性，0.26等位基因频率。
§806与804突变在同一等位基因时致病。
*最终引物的浓度和上下引的比例在引物序列上显示。列出引物序列从5’到3’，上游引物在下游引物上部。
?每个探针集下是密码子的变化。下划线密码子包括了多态或序列变化，反之其它密码子包括突变。
?遮蔽，遮蔽1-3个核苷酸的缺失。主要实验中的野生型探针序列用于每个外显子，除了外显子16。如果两个野生型探针用于一个外显子，标记做A和B探针。
§探针序列从5’到3’显示，RET外显子10、13、14和16是上游探针，反之，外显子11是下游探针。已知突变的位点加粗，可能的多态性或序列变化位点用下划线表示。
?位置（L）探针与野生型探针序列致病密码子相比有3个核苷酸遮蔽缺失（---）。
‖用于外显子10,11突变的基因分型的MS探针的例子。在探针内致病密码子位置的相同的特定突变序列。这些探针有特定突变序列的名称，改变的序列加粗。有7个可能的从TGC 野生型半胱氨酸到其他氨基酸的突变序列改变。因此，21个MS探针中的7个特定突变探针（A GC，CGC，GGC，TA C，TCC，TTC，TGG）是用于外显子10和11突变。用于每个突变基因分型的MS探针用图解法表示，表3和补充表格1-5。
**外显子13的主要和第二次试验用遮蔽探针。遮蔽 1bp 769 主要探针及外显子特定突变探针在密码子769多态位置有单核苷酸缺失（缺失野生型探针序列有下划线的“T”）。
??外显子16用918（ATG-ACG）密码子特定突变探针做主要实验。
所有报道的外显子14突变都包含在非标记探针下，只分析了探针数据。第二次实验，只分析了在60℃-89℃采集的非标记探针熔解的数据。
高分辨率熔解数据用之前描述由LabView编写的定制软件分析。简言之，扩增子的熔解曲线数据是规范化的，温度转移之后转换成派生图或荧光差异图。依据用于扩增分析的数据图，由于从野生型对照的视觉偏移的不同曲线形状较宽的派生熔解峰，独特形状的熔解峰（肩峰或两个峰），熔解温度的偏移，和/或荧光不同来检测序列变化。扩增熔解曲线，派生图，荧光不同的图都可以用来检测RET序列变化。非标记探针熔解数据直接转换成派生图。外显子14探针数据标准化，在分析之前指数背景已消除。
在派生熔解峰的1/2出估计非标记探针数据的Tms。杂合样品的△Tms定义为野生型等位基因Tm减去变化（突变，多态性，或序列变化等位基因）等位基因Tm的值。注意：当变化等位基因的Tm值高于野生型的等位基因Tm（例如：和互补的特定突变探针），△Tms的值是否定的。杂合样品的探针数据导致肩峰或平稳形状的峰，峰面积分为1/4，1/2和1/4野生型范围，变化等位基因Tms在这些区域的边界。因为纯合子序列变化（没有野生型等位基因）或变化等位基因Tm值与野生型等位基因Tm值相同时（没有可识别的野生型等位基因）当只有单个峰是显而易见的。之后，野生型对照样品Tm在计算△Tms时用于计算野生型等位基因Tm。野生型样品也会导致单一的峰，所以，从野生型对照Tm减去样品的单个等位基因Tm值。
每个RET序列变化的主要探针△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针。如果RET突变无法利用（表1），用之前描述的临近的参数估计预计△Tms值。以经验为主的决定和预测RET序列变化的△Tm值与主要探针确定△Tm的范围，期望特定探针选项分组突变。补充表1-5（参阅https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）显示△Tm的范围及主要探针分析的突变分组及每个可用的RET序列变化和主要探针及选择的第二个探针的△Tm值。Tm标线放置在派生的平面图，通过从野生型对照等位基因的Tm减去主要实验的△Tm范围计算Tm，如外显子10和11主要探针所示。这些Tm知道方针便于快速、视觉分组突变样品，选择第二次试验的特定突变的探针。但是，计算每个样品的△Tm值可以更好的对照由特定样品的不同引起的系统Tm值的偏移（改变盐的浓度，不同的样品提纯方法或温度不精确）。
盲研究
29个RET突变样品（表1中列出的可用的突变，多态性和序列变化）和5个野生型样品用于生成盲研究。外显子13，14各分析10个样品，外显子11分析20个样品，外显子10分析28个样品（补充表格6， https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。每个外显子，野生型样品和变化的样
品数目是未知的。盲研究扩增分析，用派生熔解曲线数据的独特的派生峰形状和从野生型对照的Tm移动可以明显的区分序列变化，虽然RET序列变化可以在三种平面图中检测：熔解曲线，派生熔解曲线，荧光信号不同。用WT10A，WT13探针的主要实验的扩增子派生熔解数据分别用来扫描外显子10和13的突变。
从主要实验的每个样品的探针数据计算△Tm值（如果需要，从第二次实验中计算）。△Tm数据表用来决定基因型或从第二次实验中选择特定突变的探针（补充表1-5；
https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。表3（补充表1-5的简化版本，https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）显示了RET 基因分型实验的实验原理图，也可以用于选择第二个探针。Tm标线选择外显子10和11特异突变探针的能力与用计算每个样品的Tm值来选择探针相比较。主要实验之后，样品标记为野生型，外显子13多态性，外显子16密码子918突变，或其他RET序列变化。检测序列变化的主要探针的△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针，在RET序列突变的地方进行基因分析。
结果
实验设计
RET外显子10、11、13、14和16的基因分型通过两个步骤完成，闭管实验设计包括主要和次要的实验（表3）。因为用了DNA双链饱和染料，每个反应生成非标记探针和扩增子熔解数据。主要实验包括7个PCR反应和8条探针，用于扫描序列变化和分辨一些基因型（野生外显子，外显子13密码子769多态性和外显子16密码子918突变）。在主要实验中只检测了序列变化但没有基因分型的外显子在第二次实验中用选择的探针进行测试。只用扩增数据检测稀有序列变化的样品（探针下的野生型序列）或在第二次试验中用特定突变探针没有基因分型的稀有序列变化需要通过测序来确定基因型（实验的外显子的~0.2%）。
外显子10和11：多重突变热点
MEN2A和FMTC的主要突变位于外显子10（密码子609、611、618和620）和11（密码子630和634），且野生型半胱氨酸的密码子DNA序列“TGC”发生单核苷酸改变。外显子10和11报道的序列变化>40（表1）。
RET10外显子的主要实验包括两个单独的实验和两条探针。WT10A探针覆盖了密码子611和609，WT10B探针覆盖了密码子618和620（图1a）。所有密码子618和620突变的样品在WT10A探针下有野生型序列且有和野生型对照样品的Tm值相同（图1b）。五个密码子609和
*RET5个外显子的主要实验中包括了7个PCR反应和8条探针（外显子14是多重的）。列出的主要探针与每个RET外显子相对：WT，野生型；MS，特定突变。主要实验用外显子13密码子769（CTT→CTG）多态和外显子16密码子918（ATG→A CG）的突变的探针及扩增子的熔解数据来区分野生型。从主要实验数据（检测外显子的7%）中的△Tm值选择第二个探针，检测其它的序列变化。有两个例外，样品需要测序（很少）：1）外显子16检测的其它序列变化而不是密码子918突变，或2）主要探针检测的序列变化的△Tm值在选择的第二个探针给定范围之外。这样的话主要探针会检测到两个以上的序列变化或检测到异常序列的变化。
?列出的主要实验的Tm值用于决定样品的基因型或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化。野生型样品在野生型对照的0.25℃范围之内。
?野生型序列在探针下。调用野生基因型的分析扩增数据或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化（扩增熔解曲线偏移虽然探针数据显示是野生型）。只用扩增熔解数据检测出来的稀有突变需要测序判断基因型（实验的外显子<0.2）。
§由于突变或普通密码子769多态的序列变化。遮蔽1bp 769探针区别WT13探针检测到的其它序列变化的多态性。
?用主要实验探针检测外显子的序列变化部分。
‖只有第二次实验的探针用于主要实验检测出来的序列变化的基因分型。根据主要探针与样品的△Tm值选择探针，形象的用Tm标线（图2a，补充的图1a和2a；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）或计算Tm值（补充表1-5；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。如果选择的探针不能基因分型序列变化（外显子的0.2%），需要对样品进行测序，例：外显子11（GA C→GAT）多态性。
**位置探针（L）：L10A611遮蔽，L10B620遮蔽，L11634遮蔽分别与主要实验探针WT10A，WT10B和
WT11一起使用检测序列变化。
611样品中的每一个都含有一个突变等位基因，比野生型等位基因的熔解温度要低。相反的，WT10B探针，密码子609和611突变样品的Tm值和野生样品的相同，但是每10个密码子609和611突变样品有一个突变等位基因，熔解温度比野生型等位基因低（图1e）。外显子10所有的RET序列变化通过用高分辨率熔解曲线分析的标准化熔解曲线，派生图或荧光信号的不同数据（图1、c、d、f和g；数据没有显示）来检测。这些数据证实了不在非标记探针下的突变可以用扩增熔解数据检测出来（例：图1中比较蓝色突变的痕迹，b对c）。
在主要实验中用野生型探针识别每个探针下的野生序列，样品Tm值与野生型对照等位基因Tm值相差±0.25℃（表3；补充表1；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。RET序列变化的样品有一个等位基因，其Tm值小于野生型等位基因，△Tm值>0.25℃。限制在第二次实验中基因分型需要的特定突变探针的数目，△Tm值范围用于安装相似的△Tm值分组RET序列变化。△Tm值值的范围用于快速生成Tm标线，视觉上选择第二次试验探针。例如：图2a的WT10B探针数据显示13个样品通过Tm标线，视觉上分为一个野生型组和两个突变组。第一个突变组，包含密码子618或620的T A C、T C C、T T C和TG G，△Tm值在3.3℃到5℃的△Tm范围内（图
2a；表3；补充表1；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。这一组的样品在第二次实验中MS10B的探针集1需要4个探针（图2，b-e）。第二个突变组，包括密码子618和620的 AGC、CGC和GGC突变，△Tm值在0.25℃到3.3℃的△Tm范围内。这个突变组在第二次实验中MS10B的探针集2需要3个探针（图2，f-h）。相同的方法用于包含密码子609和611突变的WT110A 探针数据（表3；补充图1；补充表2；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。外显子10的主要实验用的△Tm值来自于两个外显子10的野生型探针限制来自28至≤8基因型未知突变的可能基因型。
为了减少第二次实验中基因分型突变所需的探针的数目，外显子10的每个特定突变探针在致病密码子范围有相同的序列改变（表2）。一个致病密码子的补充突变等位基因导致与探针只有一个错配，且Tm值比有两个错配（表2，b-h）的野生型等位基因高2℃-5℃。如果突变在不同的位置，突变等位基因与探针有三个错配，且熔解Tm值低于野生型（例，图2 TG G突变，b-d，粉色痕迹）。如果突变与探针序列改变在同一位置，但是不与探针互补，此时突变等位基因的Tm值接近于野生型等位基因的Tm值，因为这个等位基因与探针有两个错配。分析时，如果与野生等位基因熔解曲线不相同，这些突变等位基因因为熔解曲线相似而被遮蔽（如：图2g遮蔽的A GC和G GC，红色和灰色的痕迹）。偶尔，一个突变等位基因和非互补特定突变探针会显示比预期高的遮蔽熔解。例如：密码子618（TGC→T C C）和620（TGC→
T C C）突变比野生等位基因和MS618/620T A C和T T C探针（图2， b和d，橙色痕迹）较稳定
（△Tm-1.7℃至-2.0℃）。即使如此，两个杂合T T C突变通过与互补MS618/620T C C探针（△Tm-4.7℃）的较高的Tm值而容易区分（图2c，橙色痕迹）。
图1：检测RET外显子10序列
变化的主要实验。a：RET10外
显子10的图示，红色方块显示
密码子609和611，蓝色的方块
显示密码子610和620。外显子
10的主要实验用WT序列的两
个非标记探针。如图所示，
WT10A探针检测密码子609和
611突变，反之WT10B检测密
码子618和620突变。每个图
中，显示一式两份三个野生型对
照（WT，黑色痕迹），及一式
两份（红色痕迹）两个密码子
609和三个密码子611突变样
品、五个密码子618和620突变
（蓝色痕迹）。3个左面的图是
WT10A探针反应的非标记探针
和扩增子的高分辨率熔解数据，
右面的3个图是WT10B的数
据。对于每个探针，最厚重的痕
迹线与探针检测的突变一起使
用，稀疏的痕迹线只于扩增子检
测的突变一起使用。b：WT10A
探针数据的派生熔解图。等位基
因分为两个Tm范围，且每个范
围有预测的密码子突变等位基因
（609/611突变或618/620突
变），与WT等位基因一起列
出。c：WT10A探针与WT主要
实验和标记的外显子10突变样
品的扩增派生熔解曲线。d：同
样扩增数据的不同平面图。e：
WT10B探针的数据的派生熔解
平面图。等位基因分为两个Tm
范围，且每个范围有预测的密码
子突变等位基因，与野生型等
位基因一起列出。f：WT10B探
针与野生型主要实验和标记的外
显子10突变样品的扩增派生熔
解曲线。g：同样扩增数据的不
同平面图。
不管突变的位置在哪，在探针下的致病密码子的同样的突变序列改变与主要探针数据的派生熔解图非常相似（图1和2a；补充图1a；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。比如说，密码子618（TGC→T A C）和620（TGC→T A C）突变通过主要的非标记探针或扩增子熔解曲线彼此不能区分。另外，设计的第二次特定突变探针只决定突变的序列，不识别突变的密码子位置。第二次实验中包括了检测外显子10序列变化的一个位置探针，识别突变的密码子。“L10B 620 mask”位置探针，设计时含有一个遮蔽，在密码子620位置上的野生探针序列有3个核苷酸（密码子）缺失（表2），用于区分密码子618和620突变。密码子620突变等位基因与野生型等位基因的Tm值相似，所以被屏蔽，反之，610密码子突变等位基因的Tm值低于野生型（图2）。位置探针允许外显子10特定突变探针设计与两个分析的密码子的序列的改变相同，因此减少了第二次实验所需的特定突变探针的数目的1/2。任何被主要实验检测到的外显子10的突变只用一个位置探针和三至4个特定突变探针进行基因分型。
用相似的方法分析外显子11（表3；补充图2；补充表3；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,），且所有外显子11的RET序列变化用扩增子高分辨率熔解分析进行检测（没有显示数据）。外显子11的主要实验用一个在致病密码子630和634上的野生型探针。检测的外显子11的8个序列变化均有一个等位基因熔解温度低于野生型（补充表2a；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。这些样品通过主要探针的△Tm值选择的第二次实验的特定突变探针分为3个突变组。特定突变探针在密码子630和634位置有相同的序列改变（表2）。在第二次实验，密码子630或634的突变用一个位置探针和一至三个特定突变探针进行基因分型（补充图2，b-i；
https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。虽然密码子631（GAC→GAT）样品在主要实验中检测，这个序列变化在第二次实验中在致病密码子之外，且由于与每个特定突变探针有3个错配，其熔解温度低于野生型（补充表2，e-g）。稀有密码子631序列变化没有被选择的特点突变的探针基因分型，需要测序鉴定其基因型。
图2： RET外显子10密码子618和620的突变基因分分型。a：图1a的主要WT10B探针数据的派生熔解图。一式两份显示3个野生型对照（WT，黑色痕迹）和10个杂合突变样品，5个在密码子618（细小痕迹）和5个在密码子620（厚重痕迹）。突变密码子DNA序列的颜色和痕迹与全部图形相一致。密码子618和620突变序列的图表痕迹A GC是灰色，C GC是浅蓝色，G GC是红色，T A C是深蓝，T C C是橙色，T T C是绿色，TG G是粉色。用于生成△Tm值的Tm 标线在每个Tm标线之后列出。野生型等位基因的Tms 在黑色Tm标线之内，与野生型对照样品相差
±0.25℃。由主要探针检测到的突变等位基因被红色Tm标线分为两个△Tm范围。预测的突变序列分组进在每个痕迹后列出的每个△Tm范围内。MS探针集的第二次实验的数据，MS10B探针集1或MS10B探针集2，显示为两个突变组。b-e：△Tm值为3.3℃至5℃的突变组，用MS10B探针集1的4个探针检测：MS618/620 T A C（b）, MS618/620 T C C（c），
MS618/620 T T C（d）和MS618/620 C GC（e）。f-h：△Tm值为0.25℃至3.3℃的突变组，用MS10B探针集2的3个探针检测：MS618/620 A GC（f）,
MS618/620 C GC（g）, MS618/620 G GC（h）。在每个特定突变图中（b-h），列出了与MS探针互补的DNA序列突变密码子。i：所有突变等位基因（主要WT10B探针数据，△Tm值0.25℃至0.5℃）也用位置探针L10B 620 mask 查找检测的突变的密码子位置。显示两个派生熔解温度范围，标记密码子618突变等位基因（618MUT）及WT等位基因，且遮蔽密码子
620突变等位基因（620 MASK）。
外显子13：突变旁边的普通多态
外显子13包含7个报道的致病突变（表1）和在密码子769（CTT→CTG）上的等位基因频率为0.26的普通多态。高分辨率扩增熔解在野生型序列显示两个单独的熔解域（图3a）。扩增熔解单独的把密码子768（GAG→GAC）突变的杂合和纯合多态区分出来（图3，a和b）。但是，只有1/7的外显子13报告的突变可以用来研究。外显子13的5个稀有的突变包括在扩增子之内但是不在外显子13的主要探针下。因为这些其它突变可能很难用扩增熔解分析数据从普通多态区分出来，可能通过探针数据确定密码子769的存在。在确定普通多态及清晰的检查探针下的两个已报到的突变的主要实验中，包括2个单独的反应及两个非标记探针，WT13和遮蔽1bp 769（表2和3；补充表4；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。一个野生型的探针检测探针下的序列变化（表3c）。第二个探针在野生型探针序列的多态位置用单核苷酸缺失遮蔽普通密码子769的多态。用这个遮蔽探针，多态等位基因的Tm值和野生型等位基因Tm值几乎差不多。反之，768突变等位基因（GAG→GA C）熔解Tm值比野生型等位基因低3.6℃（图
3d）。如果检测到探针下的突变，第二次确定密码子768已知突变基因型（图3，e和f）。设计特定突变探针，用单核苷酸缺失遮蔽密码子769多态，因此不管是哪个多态存在，突变都可以明显的基因分型。注意768突变（GAG→GA C）等位基因被MS768 GA T+遮蔽探针遮蔽，因为探针的序列改变和突变的序列改变在同一位置，但不互补（表3f）。这些突变和野生型有同样数量及与探针错配的位置相同，和野生型有相似但不相同的Tm。
图3： RET外显子13的基因型序列变化。a：WT13探针主要实验生成的扩增子派生熔解曲线数据。一式两份显示两个野生型对照（WT，稀疏的黑色痕迹）及密码子768（GA G→GA C）杂合突变样品（MUT，厚重的黑色痕迹），密码子769（CTT→CTG）杂合多态样品（Het POLY，浅灰痕迹），769纯和多态的样品（Homo POLY，灰色痕迹）。每个基因型的颜色及痕迹的厚度在整个图中是一致的。b：同样扩增数据的不同平面图。c：WT13主要探针数据的派生熔解曲线图。显示两个Tm范围，及和WT等位基因相同的突变（MUT）和多态（POLY）的标记等位基因。d：主要“Mask 1bp 769”探针数据（密码子769多态遮蔽探针）的派生熔解曲线图。显示两个派生熔解温度范围及标记的突变等位基因（MUT）和WT等位基因、遮蔽多态等位基因（遮蔽POLY）。e和f：用MS13探针集1的两个探针检测样品的基因型：MS768 GA C+ mask（e）和MS 768 GAT+ mask（f）。这两个特定突变探针通过删除遮蔽密码子769的多态位置。与野生型等位基因、遮蔽多态等位基因（masked POLY）和遮蔽密码子768（GA G→GA C）突变等位基因（f中的遮蔽 GAC突变）相同的，与特定突变等位基因互补的突变等位基因（GA C或GA T）被标记。密码子768（GA G→GA T）突变不能用于测试。
外显子14：多重探针分析
主要实验的外显子14，两个野生型的探针同时用于一个反应，用来检测所有已报道的外显子14的突变，同时消除密码子836（p.S836S）多态性（图4；a和b；表3；补充表5；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。WT14A探针在65℃-76℃检测密码子804和806突变，反之，
WT14B探针在76℃-85℃检测密码子844和852序列变化。WT14A主要探针检测的序列变化，第二次基因分型实验用3个特定突变探针（MS14A探针集1；图4；c-e）。例如：密码子804（GTG→AT G）突变等位基因通过比野生型等位基因高的Tm值基因分型。野生型等位基因与MS 480 A TG探针（表4c）互补且被不互补的MS 804 T TG和C TG探针遮蔽（图4，d和e）。除了不互补遮蔽之外的所有需要检查的密码子480突变等位基因，特定突变探针与野生型等位基因有相同的Tm值。设计MS 844 CTG和MS 852 AT G这两个探针，来检测在主要WT14B探针下的已知序列变化（没有显示数据）。
外显子16：主要特定探针
因为95%的MEN2B事例有RET外显子19密码子918（ATG→A C G）突变引起的，外显子16主要实验用一个特定突变的探针，密码子918突变等位基因的Tm值高于野生型等位基因（△Tm-5.6；表4f），扩增子数据证实从野生型控制偏移（没有显示数据）。密码子922序列变化，在探针下，密码子912稀有突变在扩增子之内，不能用于测试。
图4：外显子14和16内的突变的基因分型。a：在一个反应中的两个野生型外显子14主要实验探针数据生成的派生熔解曲线图。WT14A探针数据的温度范围是65℃-76℃，WT14B探针数据的温度范围是76℃-85℃。一式两份显示三个野生型对照（黑色痕迹）、密码子804（GTG→A TG）（深灰痕迹）（GTG→T TG）（浅灰痕迹）两个杂合突变样品。密码子804（GTG→T TG）突变不可用。图表中所用的颜色是一致的。显示标记的突变等位基因（MUT）和WT等位基因的派生熔解温度范围。b:用材料和方法描述的额外的标准化和指数背景移动，数据与a相同。c-e：和b一样的分析图。第二次实验中用MS14A探针集1中的三个探针检测突变样品：MS 804 A TG（c），MS 804 T TG（d）和MS 804 C TG（e）。和WT等位基因一样标记互补密码子突变DNA序列，且遮蔽突变等位基因（遮蔽“密码子DNA序列”MUT）。f：外显子16密码子918特定突变探针（MS918A C G）主要实验数据的派生熔解曲线图。一式两份显示三个野生型对照（黑色痕迹）、密码子918（ATG →A C G）（灰色痕迹）两个杂合突变样品。突变等位基因与
WT等位基因一起标记。
盲研究
在RET外显子基因分型实验中，测试5个野生型样品和29个可用的RET序列变化盲样品组合（补充表6；https://www.wendangku.net/doc/5e2893108.html,）。在主要实验中把不同于19野生型外显子的59个RET序列变化基因分型。另外，外显子13多态样品的纯合与杂合样品，以及外显子16密码子918（ATG→A C G）突变，在主要实验中基因分型。探针和扩增子数据结果是一致的。不论第二次实验通过Tm标线选择或计算每个样品的△Tm值，之后用△Tm数据表选择特定突变集合，外显子10和11的结果相同。对于每个突变，基因分型只需2-5个探针，且不需要测序。第二次实验基因分型主要实验检测到的主要RET序列变化。虽然主要实验检测到外显子11密码子631序列变化样品，第二次实验并没有设计用于此为点基因分型的特定突变探针，且只有这些样品需要测序进行基因分型。
讨论
虽然测序是RET基因分型的标准，突变扫描是比较划算的，因为测试的大部分外显子是野生型的。检测不定时发作骨髓甲状腺癌病人的RET突变，然而实际上只有10-25%的病人有生殖细胞RET突变。此外，因为MEN2是常染色体显性紊乱，MEN2患者在一个外显子有一个RET突变，其它外显子是野生型（或有多态）。MEN2病人的亲属一般测试RET突变且可能在一个外显子有突变或所有测试的外显子都是野生型。假设33%的测试MEN2突变的病人实际上在检测的5个外显子中有一个外显子有一个RET生殖突变，则测试的外显子的93%是野生型或不致病多态基因型。
扩增子高分辨率熔解分析可以检测100%的RET序列变化。虽然扩增子高分辨率熔解分析可以区分独特的杂合子，但是很多RET基因型不能区分出来，因为不同的序列变化有相似的扩增熔解曲线。添加非标记探针可以在相同的熔解数据上分析扩增子及探针数据。但是，有一些RET突变在野生型非标记探针存在反应的情况下仍不能区分。比如：RET突变“TAC”可以在密码子618或620中发现，每个突变导致差不多的探针熔解，因为野生型探针覆盖两个突变，且最近的碱基是相同的。
为了用最小数目的非标记探针及反应完成RET突变的基因分型，发明了一种连续的两步法，包括主要实验和第二次实验。主要实验通过扩增子熔解检测引物间的突变，用非标记探针法分析RET突变热点。主要实验用到的大部分探针式野生型序列。外显子特定突变探针是个例外，其与密码子918普通 MEN2B突变互补（95%MEN2B情况）。另外，用遮蔽技术设计的主
要外显子13探针用于明显的区分普通密码子769（CTT→CT G）多态和密码子768突变。在主要实验中，用7个PCR反应和8个探针，讲RET外显子（93%）大多数基因分型为野生型。这个主要实验同时也基因分型外显子16密码子918（ATG→A C G）突变。
用已发布的每个MEN2综合症密码子突变的频率及每个MEN2综合症的平均发生率来评估主要实验探针检测的RET突变的百分率：MEN2A，75%；FMTC，20%；MEN2B，5%。外显子10、11、13、14和16的探针检测已报道的MEN2突变的98%。外显子MEN2A和FMTC突变主要在密码子634，且MEN2A病人最普通的突变在密码子634（TGC→C GC）,其频率为50%。在探针分析区域之外有稀有突变（表1），这些突变只通过扩增子熔解分析检测，之后进行测序。第二次实验用于基因分型主要实验探针检测的RET序列变化。PCR反应的第二步需要由主要实验探针数据选择的2至4个特定突变探针，基因分型每个样品。外显子10和11需要位置探针检测密码子的突变，因为外显子10和11的特定突变探针在每个致病密码子上有相同的突变核苷酸改变。只由扩增熔解分析检测到的稀有序列变化，或主要探针检测到的序列变化没有被第二次实验探针进行基因分型的突变均需要测序，需要测序的RET外显子少于
0.2%。
一般来说，用特定突变探针产生1/3结果。首先，当突变序列与特定突变探针互补时，突变等位基因的熔解Tm要高于野生型（△Tm为-2℃至-5℃）。第二，当突变在相同位置但是与特定突变探针序列不互补时，突变等位基因被野生型等位基因相似的Tm值及稳定性所遮蔽（野生型等位基因Tm±0.5℃）。在这种情况下，没有互补的突变及野生型等位基因与探针在同一位置有一个错配，但是错配的精确的核苷酸形式是不一样的。遮蔽等位基因Tm值与野生型等位基因Tm值的接近程度取决于错配序列，其它与探针错配的数目及互补核苷酸周边的环境。例如：A::G错配突变等位基因比A::C错配野生型等位基因熔解温度高2℃（表2b，T A C突变和MS618/620T C C探针）。不管突变密码子序列改变在RET密码子618、620或609（611不能用于测试），结果都适用。第三，当突变在特定突变探针序列改变的不同位置，突变等位基因和探针有另一个错配且熔解Tm值低于野生型等位基因（△Tm为0.5℃至5℃）。如果从第二次实验选择的探针集内的特定突变获得结果，序列变化在探针下的突变位置未知，不能基因分型。在第二次实验中没有进行基因分型的样品需要测序（比如：外显子11密码子631序列变化）。
用遮蔽技术设计了6个探针用来简化复杂范围的分析。遮蔽技术在选择的序列变化的位置人工错配，使探针其它突变的分析变得简单。主要实验的外显子13遮蔽探针（遮蔽 1bp 769）和外显子13的两个特定突变探针在密码子769（CTT→CTG）多态位置有一个核苷酸缺失，这可
以清晰的检测和基因分型密码子768（GAG→GA C和GA T）的两个突变。外显子10和11的3条位置探针分别用三个核苷酸的缺失（密码子）来遮蔽一个致病密码子范围。位置探针用来鉴定探针下突变密码子的位置，减少了第二次实验中需要的特定突变探针的数据的1/2。
可能已知RET突与其它已知或未知突变是顺或反的意思，比如说在外显子14（密码子804和806突变）或外显子13（密码子791突变与密码子769多态）。对于探针数据，如果两个核苷酸在同一等位基因上改变，预期其Tm值低于任一突变。如果核苷酸在相反的等位基因改变，这两个等位基因的Tm值低于野生型，样品似乎是纯合突变。在这两种情况下，样品需要测序，因为任何一个变化的等位基因不在预测的RET突变的△Tm范围内或在第二次实验中没有识别基因型。如果第二个核苷酸改变不在探针下但是在扩增子之内，可以从RET突变基因分型的探针数据看到一个独特的扩增子派生曲线形状或低的Tm值便宜。这种情况很可能是外显子13（例：密码子791突变和密码子769多态）。当用外显子13扩增数据分析外显子13主要探针实验不能分析的稀有突变时，需要考虑由探针数据决定的普通密码子769（CTT→CTG）多态的存在。如果样品是WT13探针数据确定的野生型序列，如果扩增曲线从野生型对照偏移，应该测序样品检测稀有突变。如果WT13和Mask 1 bp 769 探针数据显示普通密码子769（杂合或纯合）多态，如果扩增曲线从769多态对照熔解曲线上偏移，需要测序样品。虽然非常稀有，RET突变可以是纯合的。如果这样的话，两个等位基因可以与合适的特定突变探针互补。
表1列出的是已报道的用RET基因分型实验分析的外显子10、11、13、14和16的MEN2突变、多态和序列变化。外显子15和8及最近报道的外显子5的没有包括的极其稀有的MEN2突变，可以通过测序这些外显子进行基因分型。表1列出的外显子11密码子631序列变化期望和测试的密码子631（GAC→GAT）样品有相同的结果：主要实验的缺失，第二次实验没有基因分型的，需要测序基因型。病人和一般群体的两个普通RET多态没有分析，因为其没有引起MEN2综合症：外显子14p.S836S（3%至10%的等位基因频率），外显子11p.G691s（17%至28%等位基因频率）。引物选择排除外显子11密码子691多态，反之外显子14多态选择探针时排除。在一个反应中用两个探针检测所有的已知外显子14密码子836多态周围的突变，没有检测多态性。密码子836多态性的外显子14扩增熔解曲线与一个突变有相似的Tm值及派生熔解曲线，且不能区分。因此外显子14扩增数据不能分析，因为可以检测密码子836多态但是不能和突变区分，产生了不必要的测序步骤。
在RET原癌基因内的其它报道的序列变化，引起先天性巨结肠症（HSCR）疾病而不是MEN2，也可能是新的突变。主要实验探针检测的新的突变或HSCR突变不能用第二次实验中
的MEN2特定突变探针进行基因分型，需要测序。扩增熔解数据检测到的新的突变或HSCR突变需要测序进行基因分型。这些事件非常不寻常，因为MEN2和HSCR有不同的临床表现。虽然如此，有报道外显子10密码子618（TGC→C GC）和620（TGC→C GC）的突变引起MEN2和HSCR。另外，外显子10密码子609（TGC→AGC和TGG）和密码子611（TGC→TCC）与HSCR有联系，而不是MEN2。随着RET基因分型实验的发展，在目的外显子的任何序列都可以基因分型，且可以根据基因型确定合适的方法。
总的来说，RET基因分型实验有两步PCR，主要实验和第二次实验。设计主要实验以便野生型外显子基因分型，区分多态性（或从实验中去除），扩增熔解数据可以检测稀有突变，普通突变用非标记探针法或扩增熔解数据来检测，不需要测序。第二次实验用限制数目的特定突变探针基因分型RET突变。这两步实验检测和基因分型盲实验中所有RET野生型、突变、多态和序列变化样品，精确度100%，用时少于测序这5个外显子的时间的1/2。 RET基因分型实验可用于其全部的位置或有嫌疑的RET突变，当RET突变在家族中是已知的，通过单个外显子，或用一个特定突变探针（位置探针，如果需要的话）进行分型。
DNA技术
DNA , 身份鉴定 鉴定亲子关系用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞等都可以用于用亲子鉴定，十分方便。 一个人有23对（46条）染色体，同一对染色体同一位置上的一对基因称为等位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检测到某个DNA位点的等位基因，一个与母亲相同，另一个就应与父亲相同，否则就存在疑问了。 利用DNA进行亲子鉴定，只要作十几至几十个DNA位点作检测，如果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不同，则可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确率几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。 DNA（脱氧核糖核酸）是人身体内细胞的原子物质。每个原子有46个染色体，另外，男性的精子细胞和女性的卵子，各有23个染色体，当精子和卵子结合的时候。这46个原子染色体就制造一个生命，因此，每人从生父处继承一半的分子物质，而另一半则从生母处获得。DNA亲子鉴定测试与传统的血液测试有很大的不同。它可以在不同的样本上进行测试，包括血液，腮腔细胞，组织细胞样本和精液样本。由于血液型号，例如A型，B型，O型或RH型，在人口中比较普遍，用于分辨每一个人，便不如DNA亲子鉴定测试有效。除了真正双胞胎外，每人的DNA是独一无二的.。由于它是这样独特，就好像指纹一样，用于亲子鉴定，DNA是最为有效的方法。我们的结果通常是比法庭上要求的还准确10到100倍。 通过遗传标记的检验与分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子试验或亲子鉴定。DNA是人体遗传的基本载体，人类的染色体是由DNA构成的，每个人体细胞有23对（46条）成对的染色体，其分别来自父亲和母亲。夫妻之间各自提供的23条染色体，在受精后相互配对，构成了23对（46条）孩子的染色体。如此循环往复构成生命的延续。 由于人体约有30亿个碱基对构成整个染色体系统，而且在生殖细胞形成前的互换和组合是随机的，所以世界上没有任何两个人具有完全相同的30亿个核苷酸的组成序列，这就是人的遗传多态性。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是DNA亲子鉴定的理论基础。 传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，这些遗传学标志为蛋白质（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而导致检材得不到理想的检验结果。此外，这些遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（PIC）有限，不能反映DNA编码区的多态性，且这些遗传标志存在生理性、病理性变异（如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后，B抗原可能呈阳性。因此，其应用价值有限。 DNA检验可弥补血清学方法的不足，故受到了法医物证学工作者的高度关注，近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。特别提到一点：同卵双胞胎的
ABO血型分型方法
华科基因ABO血型分型方法 按照Bernstein三复等位基因学说，ABO基因座主要有三个等位基因A、B和O。A、B对O为显性，O为隐性。ABO血型的表型与基因型的关系是：A型为AA或AO；B型为BB 或BO；AB型为AB；O型为OO。因为隐性基因O存在，ABO基因型不能直接用凝集反应来确定，但可通过DNA分型技术直接检测基因型，或通过表型的家系调查来推定。 ABO血型分型方法 一、ABO血型血清学分型方法 ABO血型是根据红细胞与特异性抗体的反应来分型。即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原，这种检查法称作正定型试验(direct grouping)。同时依据血清中的凝集素与标准型别红细胞膜上的凝集原反应的性质来检验结果。即用标准的A型红细胞判定抗A抗体，用标准的B型红细胞判定抗B抗体，称作反定型试验（reverse grouping)。为使结果准确，应进行正反两个试验来分型，同时也应用抗H抗体判定H抗原。当正反试验的结果与常规的ABO分型原则不符的时候,提示可能是弱亚型或变异型。 二、ABO血型DNA分型方法 分子生物学技术将ABO血型分型由血清学水平深入到基因水平。DNA分型方法都是针对核苷酸顺序差异而设计的。常用的有序列特异性引物PCR技术与PCR-RFLP技术等。序列特异性引物PCR(PCR-sequence-specific primers,PCR-SSP)是根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。该方法是以引物决定分型特异性，具有特异性强、重复性好、结果易于判定的优点。 ABO血型分型可提供以下样本： 常用样本：血液，血痕，带毛囊的毛发，口腔粘膜细胞（口腔拭子）等。 特殊检材：如精斑、混合斑、肌肉、烟蒂、胎儿的羊水等都可以采用。 采样建议： 1.我们建议您采用血痕或口腔棉签作为检测样本，或采用毛发（带毛囊）作为检测样本。 2.如果您的孩子未满四周岁，请采用血痕、口腔棉签作为样本。 3.如果孩子还未出生，则参考羊水样本抽取方法。
SNP基因分型的高通量方法
Chapter16 High-Throughput Methods for SNP Genotyping Chunming Ding and Shengnan Jin Abstract Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are ideal markers for identifying genes associated with complex diseases for two main reasons.Firstly,SNPs are densely located on the human genome at about one SNP per approximately500–1,000base pairs.Secondly,a large number of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping.These SNP genotyping platforms serve different purposes since they differ in SNP selection,reaction chemistry,signal detection,throughput,cost,and assay flexibility.This chapter aims to give an overview of some of these platforms by explaining the technologies behind each platform and identifying the best application scenarios for each platform through cross-comparison.The readers may delve into more technical details in the following chapters. Key words:Whole genome association,fine mapping,single nucleotide polymorphism,copy number variation,haplotyping. 1.Introduction Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are best known as genetic markers in disease-association studies to identify genes associated with complex diseases(1,2).However,SNPs are also used in many other clinically and biologically important applica- tions(3).A large variety of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping analysis.On the basis of the purposes of the study,SNP genotyping can be divided into two domains:whole genome association(WGA)and fine mapping(Fig.16.1).Most of the genotyping platforms can be classified accordingly.This chapter aims to briefly explain the principles behind various platforms which lead to a comparison of these platforms so that the readers will get a quick overview before delving into the technical details of some of these methods in the following chapters. A.A.Komar(ed.),Single Nucleotide Polymorphisms,Methods in Molecular Biology578, DOI10.1007/978-1-60327-411-1_16,aHumana Press,a part of Springer Science+Business Media,LLC2003,2009 245
高通量SNP基因分型技术研究进展
10 Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):3859 11 C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12 Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13 G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14 T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815 Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16 Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17 Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):97 18 zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201 收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述 姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要 在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词 高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1 一步均质法 T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2 焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料
基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用
基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用 徐茂军 (杭州商学院食品生物与环境工程学院,杭州,310035) 摘 要 建立在DNA 杂交基础上的基因探针技术是现代分子生物学中的一种常规技术。用基因探针技术检测食品中的有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。近年来,有关非放射性基因探针、DN A 生物传感器探针及分子信标探针等技术研究取得的重要进展,必将加速基因探针技术在食品微生物检测中的应用。本文对多种基因探针的技术原理与研究应用概况及最新进展进行了综述讨论。关键词 基因探针 食品病原菌 检测 作者:硕士,副教授。收稿时间:2000-08-03,改回时间:2000-10-19 食品卫生检验中的一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的病原性微生 物。这些病原性微生物的存在会给消费者的健康带来极大的危害。传统的微生物检测方法一般都涉及到对病原性微生物的培养、形态及生理生化特性的分析等程序[1] ,经长期的实践证明,这些传统方法是比较有效的,而且检测病原性微生物的特异性也比较高。但传统的微生物检测方法亦存在不少问题,例如检测成本高、速度慢、效率低,而且有些病原体生长速度很慢,很难用传统方法检测。由于传统的微生物检测方法需要对病原菌进行人工培养,因而比较适宜于对那些已知的微生物进行检测,而对一些新的病原菌用传统方法进行检测就具有一定的盲目性。另外还有些病原体,如某些类菌原体(mi -croplasm ),甚至无法通过人工培养方法获得[2]。基因探针技术作为现代分子生物学中的一种技术手段,应用于食品微生物检测不但能克服传统食品微生物检验方法的不足,而且还具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点[3]。 1 基因探针技术原理 基因探针或DNA 探针技术检测微生物的依据是核酸杂交,其工作原理是2条碱基 互补的DNA 链在适当条件下可以按碱基配对原则,形成杂交DNA 分子。已知每个生 物体的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定的,例如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有并表达了某个或某些有害的基因而产生的。从理论上讲,任何一个决定生物体特定生物学特性的DNA 序列都应该是独特的。如果将某一种微生物的特征基因DNA 双链中的一条进行标记,例如用32P 同位素标记,即可制成DNA 探针。由于DNA 分子杂交时严格遵守碱基配对的原则,通过考查待测样品与标记性DNA 探针能否形成杂交分子,即可判断样品中是否含有此种微生物,并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。 2 DNA 探针技术研究进展 自1975年Southern 首次提出DNA 探针杂交技术以来,DNA 探针技术在许多方面都已获得了改进和发展,并已成为现代分子生物学中一种基本技术。目前所使用的DNA 探针杂交方法总体上可以分为2类:一是异相杂交(heterogeneous assay )即固相杂交技术;二是同相杂交(homogeneous assay )即液相杂交技术。另外根据DNA 探针的标记方法可分为放射性标记探针和非放射性标
判断遗传方式及确定基因的位置
遗传题解题思路 ——判断遗传方式及确定基因的位置 一、遗传方式归纳及判断 细胞质遗传 Y染色体遗传 X染色体显性遗传 细胞核遗传X染色体隐性遗传 常染色体显性遗传 常染色体隐性遗传 Ⅰ.判断细胞质遗传还是细胞核遗传 此判断通常用正反交实验来进行。若是细胞质遗传，正反交结果F 1 表现型分别与其母 本相同、表现为母系遗传；若是细胞核遗传，正反交结果F 1 表现型不与母本相同，一般表现为显性性状，有时还会与性别相关（这时为伴性遗传）。 Ⅱ.判断核遗传中单基因控制的性状的五种遗传方式（用人类的单基因遗传病来说明）1．若为Y染色体遗传，其特点为传男不传女，只有男性患者没有女性患者，且男性患者的上下代男性全为患者； 2．若为X染色体显性遗传，其特点为（患者以上）代代相传，男性患者的母亲及女儿一定是患者，且患者女性多于男性； 3．若为X染色体隐性遗传，其特点为隔代遗传，交叉遗传，女性患者的父亲及儿子一定是患者，且男性患者多于女性； 4．若为常染色体显性遗传，其特点为（患者以上）代代相传，通常男女患病机会均等； 5．若为常染色体隐性遗传，其特点为隔代遗传，通常男女患病机会均等； 以上判断规律可总结为：（除细胞质遗传和Y染色体遗传外） 无中生有为隐性，隐性遗传看女病，父或子无病非伴性。（父和子都有病，则都可能）有中生无为显性，显性遗传看男病，母或女无病非伴性。（母和女都有病，则都可能） 二、确定基因的位置 Ⅰ.判断基因在细胞质还是细胞核中的方案 例1．自然界中玉米的绿色茎为稳定遗传，但在田间偶尔也会出现紫色茎的玉米。请用绿茎玉米和紫茎玉米为材料，设计一个方案判断这一性状是细胞质遗传还是细胞核遗传，写出实验方案。 ①实验方案：P♀绿茎×♂紫茎P♂绿茎×♀紫茎 ↓↓ F 1F 1 ②预测结果及结论：若两个杂交组合后代中F 1 都表现为绿茎或紫茎，则为细胞核遗传； 若杂交组合一的后代F 1表现为绿茎，若杂交组合二的后代F 1 表现为紫茎，则为细胞质遗传。 【小结】正交和反交。若正反交结果F 1 表现型分别与其母本相同、表现为母系遗传，
遗传标记STR基因座分型
遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型 摘要：STR（Short Tandem Repeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。本实验用磁珠法提取人类基因组DNA后，用三对引物（D1S1677、D4S2364和D10S1248）分别对一号染色体、四号染色体和十号染色体的STR序列进行PCR扩增，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后用EB染色凝胶后在紫外灯下观察实验结果并进行分析。通过此次实验，我们了解了STR序列的特征和相关应用，掌握了磁珠法提取人类基因组DNA技术、PCR技术，以及聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）。 关键词：STR磁珠法PCR扩增聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE） 1．引言 DNA指纹技术是一项具有广泛应用价值的技术。它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。 DNA指纹技术的发展经历了三代。第一代DNA指纹技术利用了DNA 指纹图谱。1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。众多“DNA指纹”组成“DNA指纹图谱”。第二代DNA指纹技术用PCR 的方法对STR位点进行PCR扩增可得到不同长度DNA片段，用银染或荧光的方法对扩增后的DNA片段检测得到DNA指纹。第三代DNA指纹技术是用PCR的方法对SNP位点进行PCR扩增。 STR（Short Tandem Repeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性。它们一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，这就是STR 分型。联合应用16个STR位点的特异性，其个体识别率可达0.999999999998，其父权排除率可达0.99998。 本次实验中人类基因组DNA的提取使用的是磁珠法核酸纯化技术。它采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该方法快速简捷，一般可在36分钟完成。不用多次漂洗磁珠也可确保基因组DNA的高纯度，提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达 1.7～1.9，长度可达20kb～50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术，由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。本实验以人类基因组DNA为模板，以dNTP为原料，以含有Mg2+的buffer为缓冲液，在Taq酶催化下，用特定引物（D1S1677、D4S2364和D10S1248）为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，获得不同基因座的STR扩增片段。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。总之，PCR是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分
用探针法进行基因分型的方法
用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原 癌基因进行基因分型 RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA 染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。 多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。 之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外，不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制，RET外显子测序保持黄金标准。 测序是一种耗时且昂贵的开管实验，需要生成PCR产物之后的额外操作。相反，高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验，不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之
如何判断基因位置(学生版)
如何判断基因的位置 基因是控制生物性状的基本单位，其位置可以有以下几个地方： （1）位于细胞质中还是位于细胞核中； （2）位于细胞核中的核基因又分为以下四种情况： ①位于常染色体上还是位于X染色体上；②位于常染色体上还是位于X、Y染色体的同源区段； ③位于X、Y染色体上的同源区段还是仅位于X染色体的特有区段上； ④控制两相对性状的两对等位基因是一对同源染色体上还是位于非同源染色体上。 一、探究某性状的遗传是细胞质遗传还是细胞核遗传 1、正反交法。判断某对相对性状是细胞核遗传还是细胞质遗传，应该做正交实验和反交实验。（该法必须为纯合子）（1）若正交与反交的结果，子代的性状都与母本一致，说明属于细胞质遗传。 （2）若正交与反交的结果，子代性状表现相同，与母本无关(表现的都是显性性状)，说明属于细胞核遗传。 例1、有人发现了一种受细胞质基因控制的大豆芽黄突变体（其幼苗叶片明显黄化，长大后与正常绿色植株无差异）。请你以该芽黄突变体和正常绿色植株（均为纯合子）为材料，用杂交实验的方法，验证芽黄性状属于细胞质遗传。（要求：用遗传图解表示）答案： 正交：P 红花♀×白花♂反交：P 白花♀×红花♂ ↓↓ F1 F1 若正交与反交产生的F1的性状表现都与母本相同，则该花色的遗传为细胞质遗传。 若正交与反交产生的F1的性状表现与母本无关，表现为红花或白花的一种，则该花色的遗传为细胞核遗传 二、判断基因位于x 染色体上还是常染色体上（通常不考虑性染色体的同源区段） 1、已知基因的显隐性：选择隐性雌性个体与显性雄性个体进行交配。 ①若后代中的所有雌性个体表现出显性性状，所有雄性个体表现出隐性性状，说明该基因位于X染色体上。 ②若后代中雌雄个体表现出显性性状或均表现出显隐性性状，说明该基因位于常染色体上。 3、已知雌雄个体均为纯合子：正交和反交，观察后代的表现型是否一致。 ①若后代的表现型一致，与性别无关，说明该基因位于常染色体上。 ②若后代的表现型不一致，与性别明显相关，说明该基因位于X染色体上。 例3、现有一定数量长翅果蝇和残翅果蝇（均有雌雄），且长翅对残翅为显性。请设计实验来确定其基因位于x 染色体上还是常染色体上。写出你的实验设计思路，并对可能的结果进行分析。 方法一：一对残翅雌×长翅雄 若子代雌全为长翅，雄全为残翅，这对基因在x 染色体上 若子代雌、雄全为长翅，这对基因位于常染色体上 若子代雌、雄既长翅又有残翅，这对基因位于常染色体上 方法二：多对残翅雌×长翅雄 若子代雌全为长翅，雄全为残翅，这对基因在x 染色体上 若子代雌、雄既长翅又有残翅，且长翅多于残翅，这对基因位于常染色体上 方法三：多对长翅雌×长雄 ①若残翅只出现在子代雄性个体中，则基因位于X染色体上。 ②若残翅同时出现在雌雄性个体中，则基因位于常染色体上。 例4、己知果蝇的直毛与非直毛是一对等位基因。若实验室有纯合的直毛和非直毛雌、雄果蝇亲本，你能否通过一代杂交试验确定这对等位基因是位于常染色体上还是X染色体上?请说明推导过程。答案：能。 正交和反交(即直毛×非直毛，非直毛×直毛)。 （1）若正、反交后代性状表现一致，则该等位基因位于常染色体上，（2）若正、反交后代性状表现不一致，则该等位基因位于X染色体上。 三、题目给信息要考虑性染色体的同源区段，判断基因仅位于X染色体特有区段还是在同源区段 1、选择隐性雌性个体与纯和显性雄性个体进行交配。 ①若后代中的所有雄性个体表现出显性性状，说明该基因位于X、Y染色体上的同源区段。 ②若后代中的所有雄性个体表现出隐性性状，说明该基因仅位于X染色体上。
HBV基因和亚型：分型技术
参考文献：南方医科大学硕士学位论文~《HCV基因型和亚型：分型技术、临床意义及其流行病学研究》 HBV基因型和亚型：分型技术 乙肝临床与分型研究国际现状： 乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝病毒，在全世界长期感染约3亿人，据报道每年造成约100万人死亡。基于对完整基因组的序列相似性，将诸多HBV分离株分为8个基因型A至H。HBV基因型显示特征性地理分布：基因型A流行最广，但普遍是在北欧、北美和中非;在东亚，韩国、中国、日本、波利尼西亚和越南发现了基因型B和C;基因型D也是大流行性基因型，但最要在地中海地区、中东和印度为主要分布地;基因型E是非洲的典型常见型;美国当地人和波利尼西亚发现基因型F;基因型G在西欧和北美，基因型H主要发现在中美洲。不仅对于分子流行病学的目的，HBV的基因分型是重要的；最近的几项研究也表明，一些基因型的慢性结局和肝脏疾病的严重程度可能是不同的。来自：National Center for Biotechnology Information—Viral Genotyping Tool Hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic virus, that chronically infects some 300 million people worldwide and is thought to be responsible for a million deaths annually. Numerous HBV isolates have been grouped into eight genotypes, A through H, on the basis of sequence similarities of their complete genomes. HBV genotypes show a characteristic geographical distribution: genotype A is pandemic but most prevalent in northern Europe, North America and central Africa; genotypes B and C are found in eastern Asia, Korea, China, Japan, Polynesia and Vietnam; genotype D is also pandemic but is predominant in the Mediterranean area, the Middle East and India; genotype E is typical for Africa; genotype F is found in American natives and in Polynesia; genotype G in western Europe and North America and genotype H is found predominantly in Central America. Genotyping of HBV is important not only for molecular epidemiology purposes. Several recent researches demonstrated that rate of the chronic outcome and the severity of liver disease can be different for some genotypes. 来自：National Center for Biotechnology Information—Viral Genotyping Tool 乙肝临床与分型研究中国现状： 目前（追溯至2005年），根据乙型肝炎病毒（HBV）全基因组序列差异大于8%或者S基因序列大于4%，将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型，当时报道，HBV每个基因型还可以分为不同亚型，如：A基因型可分为Aa和Ae亚型；B基因型可分为B1、B2、B3和B4亚型，C基因型可分为C1、C2、C3和C4亚型等。有研究表明，HBV基因型与感染途径、感染谱、疾病进展有一定相关性。但是在2005年，国内现有关于HBV亚型的报道。我们研究组应用特异性引物聚合酶链式反应法对我国多个城市的445份HBV感染者血清进行了HBV基因型和亚型的分析。来源：北京大学医学部微生物系，庄辉课题组 乙型肝炎病毒（HBV）是引起人兽共患病的最小DNA病毒，全球分布，引发急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、乙肝相关性肝癌，对人类健康威胁大。目前（追溯至2005年），根据HBV全基因序列异质性大于8%或者S基因序列大于4%，将HBV分为8个基因型A~H，并根据全基因序列异质性不大于8%，大于4%将HBV同一种基因型再分为不同的亚型。不同基因型、亚型的HBV各具独特的流行病学特点及分子生物学特征。并发现可能与HBV感染途径、疾病谱、病程进展以及抗病毒治疗的反应局相关性。来源：福建医科大学附属第一医院肝病中心 乙肝病毒与复制 乙型肝炎病毒(HBV)为直径42～47nm的球形颗粒(Dane颗粒)，由外壳与核心两部分组成。外壳有许多小球状颗粒，只含病毒表面抗原(HBsAg)。核心含环状双股脱氧核糖核酸(DNA)、DNA多聚酶、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。双股DNA的正链短且不完整，长度仅为负链的50%，不含开放读码区，不能编码蛋白。负链完整，长度恒定，约含3200个核苷酸，有4个大开放读码区，可编码全部病毒蛋白：①S区基因。编码病毒外壳蛋白(HBsAg)，分为S、前S1、前S2基因区共同编码3种外壳蛋白肽段，即主蛋白由S基因编码，中蛋白由前S2和S基因编码，大蛋白由前S1、前S2和S基因编码。3种外壳蛋白的功能和性质有所不同；②C基因。编码核心抗原蛋白及其可溶成分e抗原，前C基因区可能在HBV的装配和分泌中起作用；③P基因。其翻译产物为病毒的DNA多聚酶；④X基因。编码HBxAg，存在于HBsAg或HBcAg阳性病例的肝细胞核内，可能是一种转录调节蛋白。来自：百科全书
乙型肝炎病毒基因分型方法简述
乙型肝炎病毒基因分型方法简述 邵 玲 张 男 【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。 【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法 H epatitis B virus gene minute method summ ary S HA O L in Z HA N G N an 【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention. 【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method 乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A～D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A～D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A～F型,命名为G型。随后,日本和德国也相继发现了G基因型。2002年Arauz～Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。截止现今,HBV基因型可分为A～H八型。 目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。 1 基因分型原理 1.1 全基因序列测定。全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%～5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%～9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。 1.2 S基因序列测定。由于乙型肝 炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编 码HBs4的s基因、C基因及X基因(如 图),可分别对它们进行研究,从而找出各 个基因型在各个基因之间的差异。Nor2 der[5]对32例HBV患者s基因测序结果 进行分析,并建立进化树,基因型间异质 性>4%。除证实了Okamoto的A～D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A～F)。在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。 2 基因分型方法 2.1 序列测定法。即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。 2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR～RFL P)。目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。 2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。 2.4 基因型特异性线形探针检测法。该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。另外Van G eyt[12]根据A～F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)