常见病原菌分离方法

常用的几种典型的病原菌分离方法

1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术

一、目的要求

了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理

单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器

1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)

(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

(2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。

(3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。

(4) 玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularia lunata)。

2．培养基PDA斜面培养基、水琼脂培养基。

3．仪器与用品超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70％酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝锅等。

四、实验操作

(一) 利用震落法进行单孢分离

(1) 用无菌操作将熔化后冷却到60～70℃的水琼脂培养基约10 ml倒入灭菌培养皿内，凝固成平板备用。

(2) 按无菌操作要领，将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30～45°角度，将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好，以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动，使孢子稀疏地落到平板表面，振落时宁轻勿重，以防过多孢子落于水琼脂平板表面。

提示：振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。

(3) 将水琼脂平板翻转后置于显微镜载物台上，用低倍镜(10×10)寻找平板表面上的单个孢子。找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上，点涂一个圆点作为标志。

提示：可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后，待多数孢子开始萌发时再进行检查，这时较易观察，且可以保证孢子具有萌发和生长能力。

(4) 将水琼脂平板从载物台上取下，按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上，用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌，再置于25℃恒温箱培养。

(5) 数日后如果斜面培养基上生出菌丝，并形成孢子，经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的，则此菌种即是经单孢分离获得的纯菌株。

(二) 利用稀释法进行单孢分离

(1) 用灭菌水配制孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液中有20～30个左右孢子时，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25％乳酸1～2滴)。

(2) 将已熔化好并冷却到45～50℃的水琼脂培养基约10 ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。

(3) 以振落法相同步骤操作，即可获得单孢系菌种。

(三) 利用直接挑取法进行单孢分离

(1)、挑孢针的制作。把直径为3～4 mm，长约15 cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔，将一个4号昆虫针尾部插入，把针尖部2 mm左右弯折90°而成。

提示：用金属材料制作的挑孢针灭菌容易，不易碰碎，可以长期使用。

(2) 把玉米大斑病病叶置于解剖镜下，寻找目标孢子。可以先在低放大倍率(1×10)下寻找，在高放大倍率(4×10)下，观察是否为单个孢子。

(3) 找到分生孢子后，将挑孢针在酒精灯上高温灭菌，待稍冷却，用挑孢针把孢子粘上，在酒精等火焰上方移入试管斜面培养基上。25培养3～5 d后，观察是否长出纯菌落。

提示：挑孢针在挑取孢子时如果不易黏取，可以先将挑孢针在培养基上轻轻划一下，增加黏性；如果在病叶上目标真菌孢子大量成堆，或周围有其他杂菌的孢子不易分开时，可以取一个干净的载玻片，用挑孢针挑取一些孢子，在载玻片上轻轻碰击，使孢子互相散开，然后在解剖镜下寻找单个孢子，挑取分离。如果进行专性寄生菌的单孢分离，用挑孢针把孢子放在其寄主植物上即可获得单孢菌系。

五、实验作业

上交分离得到的单孢系菌种。

六、思考题

1．如采用在水琼脂平板上用孢子悬液划线后再寻找单孢的方法能否进行；单孢分离?

2．设想还可以采用什么样的方法进行真菌的单孢分离?

3. 用组织法分离长出菌落后，如果多个菌落混杂在一起如何进行进一步的分离纯化?

4. 想一想直接挑取法除了进行单孢分离外还有其他什么用途?

5．单孢子分离技术有哪些优点?

附录3 真菌和细菌的菌种保藏

病原生物纯培养的保存和贮藏技术是比较复杂而十分重要的。在实际研究工作中，经常需要将保存的菌种与一些已知的或已鉴定过的标准菌种对比。而被研究的分离物，一旦鉴定结束，也应妥善保存和贮藏，以便今后进一步研究和对比之用。菌种纯培养的保存和贮藏中最重要的是如何保存这众多的分离物，使之不会因贮藏条件不妥而死亡，不因保存方法不当而发生变异，不被其他生物污染，能长期保存其生命力和原有性状不变。为达此目标，通常都采用部分抑制或完全抑制病原生物的生长和代谢活动的方式以延长其存活期，并减少变异。常用保藏方法有：

1．室温保存许多真菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温(10～15℃)条件下，放在玻璃橱内即可。对于鞭毛菌亚门的真菌，只适宜用这种方法保存，但每隔2～3个月，就要移植一次。为了防止真菌在培养保存过程中致病力的退化和变异(如失去致病力，菌丝体变为黏液状，或失去产孢能力等)，常使用天然培养基，尽量减少糖的用量，有的直接放在灭菌的土壤中保存。室温保存的优点是简便易行，无需特殊设备，缺点是培养基易干燥，每1～3个月需要移植一次。

2．低温保存将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包好，移至2～8℃的冰箱中保藏，是最常用的保存菌种的方法。保藏时间依微生物的种类而有不同。真菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移植一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移植一次。此法为实验室和工厂菌种室常用，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备。缺点是容易变异。因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，致使微生物的代谢改变而影响了微生物的性状，并且需要屡次传代。若菌种经常使用，而条件不变，宜应用此法。如能放在-20℃或-60℃冰箱中或液氮罐中，则存活期

可以更长。但是放在-20℃或-60℃冰箱中的材料，尤其是放在液氮中的培养物外面必须密封，以防冻裂或破损。

3．石蜡油保存利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，

其油面高度应超过斜面顶部lcm，以隔绝斜面上菌种与空气接触，使之处于无氧条件下，以抑制菌种的生长与代谢活动，而培养基也不会干燥。这是许多真菌菌种的保存方法，效果好(一般可保藏2年以上不死)而成本低。无芽孢的细菌也可保存一年左右。加入石蜡油的菌种管可以放在室温下，也可放在冰箱中。当重新需要菌种时，只要用接种钩从油面下钩取小块菌体重新放在斜面或平板上即可恢复生长。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移植。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

4．灭菌蒸馏水悬浮保存土壤浸液和蒸馏水，经过灭菌以后，把细菌菌苔悬浮到这些液体中，密封后保存在冰箱中，其存活期可长达10年，是很理想而简易的保存方法。

几乎所有的真菌均可采用蒸馏水保存法，即把子板上生长的菌丝切成小块，连同培养基一起放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后放在室温下即可长期保存。是目前最理想的保存方法。

5．干燥保存许多菌种在干燥后就会死亡，但真菌的菌丝体和孢子，有芽孢的细菌等，经适当的干燥后可以长期存活。常用的干燥保存法是使用灭菌。速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。

(1) 以无菌的脱脂牛奶(作为保护剂，使蛋白质不致变性)将微生物制成细胞悬液，加入长颈球形底的小玻璃管内，此管又称安瓿。

(2) 将安瓿放在低温下冷冻。冷冻剂为干冰(固体二氧化碳)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃，将安瓿插入冷冻剂，只需冷冻4～5 min。

(3) 准备冷冻槽。槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。

(4) 安瓿放入冷冻槽中的干燥瓶内。

(5) 抽气一般若在30min内，能达到102.67 Pa真空度时，则干燥物不致溶化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.66 Pa，保持压力6～8 h即可。

(6) 封口。抽真空干燥后，取出安瓿，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约l0min(即可达到26.66 Pa)，以在真空状态下封口。拟煤气喷灯的细火焰在安瓿颈中央进行封口。密封的安瓿管可盛放在冰箱中。

(7) 菌种的恢复生长。将安瓿管顶部用酒精消毒后，在火焰上加热，然后加一滴灭菌水使玻璃管炸裂，再向管中加入0.2 ml的灭菌水或蛋白胨水，静置数分钟后，摇匀成悬浮液，吸出放在培养基平板上。置温箱中适温下便可恢复生长。

此法为菌种保存方法中最有效的方法。对一般生活力强的微生物或其孢子以及无芽孢细菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。但设备和操作都比较复杂，适用于菌种长期保存。

常见病原菌采样分离过程

金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 首次分离时，将样品在6.5%NaCl营养肉汤中，45℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，BEA）上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 需要注意的是由于BEA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似菌株在BEA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确率。

植物病原菌分离方法

病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝

感染性疾病病原菌分离与鉴定技术

感染性疾病病原菌分离与鉴定技术 随着现代医学的不断发展，对于感染性疾病的防治越来越重视。感染性疾病是由病原微生物侵入人体后引起的一类传染病，包括 细菌性、病毒性、真菌性等多种类型，对于世界人民的身体健康 和社会经济发展都有着严重的威胁。因此，及时准确地分离和鉴 定病原菌对于临床治疗和流行病学研究具有非常重要的意义。 感染性疾病病原菌的分离是指从患者的临床样本中分离出可疑 的病原菌，包括血液、尿液、呕吐物、痰液、脑脊液等。分离要 求样本处理得当，以避免假阳性和假阴性的发生。一般来说，分 离常用的方法有血培养、尿培养、痰培养、脑脊液培养等，根据 具体情况选择不同的培养基和培养条件。现在常用的快速定量检 测方法有PCR、ELISA、荧光定量PCR等。这些方法在分离病原 菌方面的速度和准确度都有了显著的提高，成为目前最常用的方 法之一。 病原菌的鉴定是指对分离出的菌株进行鉴定，确定它的种属和 亚种，这对于准确选择抗生素和设计药物产生重要的指导作用， 同时为对疾病预防和流行病学提供有力的依据。病原菌的鉴定需 要综合运用多种检测方法，包括荧光染色、酵母菌诊断、多位点 重复序列PCR、16S rRNA基因序列等，常见的鉴定方法有手工鉴 定法和自动化鉴定法。手工鉴定法确定每个菌株的隐藏特性，自 动化鉴定法则依赖于荧光分析和基因序列，可以快速精准地鉴定

数百种常见和罕见的病原菌。鉴定结果可以提供临床医生选择适当的治疗方法和针对性的药物，从而提高治愈率和防治效果。 总之，感染性疾病病原菌分离与鉴定技术的不断完善和创新，为医学和卫生事业的发展提供了新的动力，也为预防和控制感染性疾病提供了更有力的技术支持。我们应该认真贯彻落实国家防疫政策，注重对感染性疾病的防治工作，加强对感染性疾病病原菌分离与鉴定技术的研发和应用，为人民群众健康保驾护航，保障社会和谐平稳发展。

植物病原菌分离方法

第四章植物病原菌分离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ?分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 ?分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离 有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸， 但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3－5min；所需时间因材料 不同而异，消毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒 ⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。

◆最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。处理种子5－10min， 长的可达20－30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而以 灭菌水换洗八九次。 ?培养基的准备 ●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。 寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。 一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多） ●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当 或存放的时间太长。 ●植物病原菌的分离培养基，可以分为通用培养基和选择性培养基。 通用培养基不加特殊抑制杂菌生长的物质；选择性培养基一般都要加制 止杂菌生长的物质。 ◆植物病原细菌分离时，要避免使用选择性培养基，因为抑制杂菌 的物质一般并不杀死杂菌，而是抑制杂菌的生长，因此，从分离单 个菌落繁殖得到的菌株仍可能有杂菌。 三、植物病原细菌的分离技术 ●植物病原细菌一般用稀释分离方法。 因为在病组织中病原细菌数量巨大，分离材料中所带的杂菌又大多是细菌，用稀释培养的方法就可以使病原细菌与杂菌分开，形成分散的菌

细菌的分离与培养

细菌的分离与培养 实验目的： 掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。 实验材料： 菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容： 一、平板划线接种法（分离培养法） 原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。 用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。 课时安排：2课时 操作方法（三区划线法）： 1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。 2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。 3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。 二、液体培养基接种法 用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。 操作方法： 右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。 1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。 2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。 3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。 三、半固体穿刺接种法 用途：观察细菌动力，保存菌种。方法： 1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。 2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法 四、斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。

植物病原菌的分离

植物病原菌的分离 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备 1.分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2.分离用具：酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤 （一）分离前的准备工作： 1.工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2.分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备(2)

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备（2） 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病 生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶 部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病 灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增 菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧 后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用 灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种 环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。划 线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面 轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注 明接种材料、日期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一 小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色 后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。 鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。 血液及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或 用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。 接种后的平板经30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后，检查菌落生长情况，

常见病原菌分离方法

常用的几种典型的病原菌分离方法 1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移臵培养皿的培养基中，然后培养。 2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。，用灭菌水冲洗几次，移臵培养基面上。 3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。 4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。 5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移臵培养基上。 6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。 7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。 附录2 真菌单孢子分离技术 一、目的要求 了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。 二、基本原理 单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，臵适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。 三、材料、用具与仪器 1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考) (1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。 (2) 玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。 (3) 玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。

病原体分离与鉴定实验技术

病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。 一、细菌的分离与鉴定 1. 样本采集与处理 首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。 2. 培养与分离 将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。 3. 形态学鉴定 通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。 4. 生理生化鉴定 细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。

5. 血清学鉴定 血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血 杆菌等。 二、病毒的分离与鉴定 1. 细胞培养法 病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。将待测样本接种于合 适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制 等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。 2. 核酸扩增技术 核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。通过PCR、实时 荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进 行病毒的鉴定。 3. 血清学检测 病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。通过血清学检测，可以检 测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。 三、真菌与寄生虫的分离与鉴定 1. 样本采集与处理 对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物 等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。

实验二 植物病原菌的组织分离

实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化 一、实验目的 通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。 二、材料和用具 玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿 三、分离材料的选择 为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。 四、植物病原菌的分离方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 （一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。 1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病） （1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。期间融化培养基备用。 （2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。 （3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。 （4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。 （5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。倒置于25—28℃恒温箱内培养。 （6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。在4℃冰箱中保存。 2、种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离） 选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟，然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。 3、病组织内部病原菌的分离（大豆枯萎病菌的分离） 取大豆枯萎病病根沾取70%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在灯焰灭过菌的解剖刀切去表皮，然后切取其中小块变色的病组织，移植于培养基表面培养，每皿放3—4块，倒置于25℃温箱中培养2—3天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。 （二）.稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离，本次实验以白菜软腐病作为材料进行分类离。 白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下

植物病原菌的分离培养

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。 (一)分离材料的选择 分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。 (二)分离方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离 A:分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。 3．分离材料的选择 用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料 B、植物病原菌的分离 1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离： 首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作： ①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。 ②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）。 ③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。 ④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。 ⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组

【精品】植物病原真菌的分离培养

【精品】植物病原真菌的分离培养 植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。 一、实验材料 1. 植物体、果实或病株。 2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。 3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。 二、分离方法 1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。 2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。 3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。 4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。 5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。 三、注意事项 1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。 2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。 3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。 4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。

植物病原菌分离方法

植物病原菌分离方法（综合版） 植物病原细菌分离方法： 分离培养基（NA） 植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法： 1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次 后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液； 2.配制不同稀释度的细菌悬浮液； 准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水； 3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后 再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推； 4.平板划线分离，28℃培养2-3天； 5.挑取单菌落划线再次纯化； 菌落形态观察： 1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基 颜色的变化等； 2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀 3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。有透明的、半透明的或不透明的， 表面有暗色或发亮的 4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征 注： 1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一 种是主要的； 2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离； 3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定 其致病性，最终确定病原菌； 4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一 种是真正的病原细菌； 5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。 6.各种植物病原细菌生长快慢不同： 假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天 土壤杆菌属细菌2-3天 黄单胞菌属细菌3-4天 棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落 植物病原细菌生长量测定法 直接法 测体积 粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的 离心，然后观察沉降物的体积。 称干重 采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。 离心法（细菌） 将待测培养液离心，再用清水洗涤离心1~5次后干燥，可用105℃、

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养.病原物的分离与培养，需经以以几个步骤： 1。有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3。病原菌的分离 4.病原菌的培养。 －、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中,需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。（一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。 1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小,凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长1～2 h.但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧.干热灭菌使用的仪器是烘箱。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌.涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。 进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火;在

病原菌分离培养总结

病原菌(de)分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌(de)分离培养,是植物病理实验室工作中(de)基本技能.为了获得某微生物(de)纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜(de)生活条件,即让病原菌生活在适宜(de)培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长(de)环境,从而得到纯菌株. 植物病原真菌(de)分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种.最常用(de)方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子(de)病原真菌(de)分离. 为了获得分离菌(de)纯培养,必须要进行分离菌(de)纯化,纯化(de)方法类似于分离工作中采用(de)稀释分离法或划线分离法. 二．病原真菌(de)分离培养（花生褐斑病为例） 1.分离(de)准备工作 （1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色,淡黄色晕圈.背面有许多黑色小点,呈同心轮纹状排列. （2）培养基(de)准备: PDA培养基,加热熔化,紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等.（升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心）. 2.组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手,无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌

操作间时,呼吸要轻,不要说话. （2）酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动,保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病(de)症状典型病叶(或其他分离材料),选择典型(de)单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块. （选择新患病(de)组织作为分离(de)材料,可以减少腐生菌混入(de)机会.腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败(de)部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织(de)部分分离.） （4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—%升汞—无菌水—无菌水—无菌水）,将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些）,然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留(de)消毒剂. （5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放3-5块.（在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余(de)水,以大大减少病组织附近出现细菌污染）. （6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养.一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致(de)菌落,则多半为要分离(de)病原菌. （7）除根据菌落(de)一致性初步确定长出(de)菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,并且根据保湿培养(de)结果进一步确定； （8）在无菌条件下,用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病

植物病原菌分离方法

第四章植物病原菌分 离与纯化 植物病原菌一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ❿分离的准备工作 ➢无菌室操作前保持清洁无菌 ➢接种工作准备 ➢培养基的准备 ❿分离材料选择

➢以收获的材料从病健交界处采样 ➢果实腐烂从开始腐烂处分离 ➢根腐和枯萎层可能从离土较远处分离 ➢有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 ➢有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等 发病后分离 ❿组织表面消毒 ➢⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也 可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3 －5min；所需时间因材料不同而异， 消毒后灭菌水3－5次 ➢附在组织表皮的气泡，含使消毒剂

不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒 ➢⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使 用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。 ➢优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 ➢（3）酒精：70％，浸很短时

间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较 安全的方法是不用药剂消毒，而 以灭菌水换洗八九次。 ❿培养基的准备 ●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。 ➢寄生性细菌对培养基的要求要比腐 生性细菌严格。 ➢一种适宜于纯培养的培养基不一定 适宜于分离（杂菌太多） ●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太