实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定

实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定实训8 植物病害病原物的分离培养和鉴定

1(实训目标

通过对植物病原物分离培养方法的学习和实际操作，掌握病原物分离培养的基本原理和基本方法，为植物病原物的鉴定及病害的正确诊断提供依据;了解各种病原物的形态和生物学特性，为植物病害的有效防治打下基础。

2(实训材料

(1)材料新采集的植物真菌、细菌、线虫病害的典型症状植株、PDA培养基、牛汁胨平板培养基等。

(2)仪器用具超净工作台、显微镜、解剖镜、恒温箱、三角瓶、灭菌培养皿、解剖剪、小镊子、移植环、酒精灯、70%酒精、95%酒精、0.1%升汞水或7%漂白粉消毒液、5%来苏尔、灭菌水、滤纸、蜡笔、标签、胶水、火柴、玻璃漏斗(直径10,15cm)、铁架台、橡皮管、弹簧夹、尖嘴玻璃管、网筛、挑针、竹针或毛针、凹穴玻片等。

3(实训内容

(1)植物病原真菌的分离培养;

(2)植物病原细菌的的分离培养;

(3)植物病原线虫的分离培养。

4(操作步骤与方法

1)植物病原真菌的分离培养

对植物病原真菌通常采用的是组织分离法。此方法的基本原理是:创造一个适合真菌生长的无菌营养环境，促使染病植物组织中的病原真菌在人工培养基上大量生长、繁殖，使其成为纯菌种，以便为病原鉴定和病害诊断提供实物依据。

(1)分离材料的选择及处理

选择新鲜的典型症状植株、器官或组织，洗净，晾干，取新鲜病斑病健交界部分，切成,5mm见方小块用作分离材料。将分离材料置于灭菌的小容器中，先用70%酒精漂洗约2,3

3s，迅速倒去，以避免材料表面产生气泡;然后用0.1%升汞溶液消毒

1~2min(消毒时间因材料厚度不同而异;消毒剂也可根据不同情况选用漂白粉、次氯酸钠等)，再经无菌水漂洗3,4次，最后用灭菌的滤纸吸干材料上的水。

(2)工具的消毒、灭菌

先打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒;分离用的容器和镊子用95%酒精擦洗后经火焰灼烧灭菌。

分离也可在没有尘土而空气相对静止的室内进行，方法是擦净工作台，在台面上铺一块湿毛巾，地面洒水，然后在室内喷洒5%来苏尔熏蒸灭菌2~3h即可。

(3)平板PDA的制作

将三角瓶中的PDA培养基置于水浴锅或微波炉中融化，取出摇匀，自然降温至45?C左右后，在超净工作台上经无菌操作将培养基倒入已灭菌的培养皿中(厚度约2,3mm)，并轻轻摇动，静置台面冷却即成。

(4)分离培养

在无菌操作下用镊子将消毒后的材料移入平板PDA培养基上，按一定距离排列整齐。一般病组织平板培养至少需要3个以上的重复，以增加获得致病菌的机会。在培养皿盖上标明分离材料、日期等。将培养皿底部向上放入塑料袋中，扎紧袋口，置恒温培养箱中在室温

下培养，或置室内阴暗处培养2,5d即可检查结果。

2)植物病原细菌的分离培养

(1)材料处理

在病原细菌的分离培养中，材料的选择及表面消毒与病原真菌的分离培养基本相同，但

消毒液通常是用1:14的漂白粉溶液处理3,5min ,然后用无菌水冲洗2,3次。培养基除了

PDA外，通常采用肉汁胨培养基(NA)。

2)制备细菌悬浮液 (

在灭菌培养皿中盛入少量无菌水，将经表面消毒和无菌水冲洗过3次后的病组织块置培养皿的无菌水中，用灭菌剪刀将病组织剪碎，静置10,15min，使组织中的细菌流入水中成为悬浮液。

(3)划线分离用经过火焰灭菌的移植环蘸取少量细菌悬浮液，在牛汁胨平板培养基上进行划线培养，以使细菌分开形成分散的菌落。具体方法是，先在平板的一侧顺序划3,5条线，再将培养皿转90?，将移植环经火焰灼烧灭菌后，从第二条线末端开始，用

附图8-1 细菌的平板划线分离相同方法再划3,5条线(见附图8-1)。然后在培养

皿盖上标明分离材料和日期等。

(4)培养及结果鉴定将分离后的培养皿翻转放入塑料袋中，扎紧袋口，置恒温培养

箱中适温培养24,48h，可观察结果。

3)植物病原线虫的分离和鉴定

线虫是低等动物，它们的分离方法与植物的其他病原生物不同。在植物线虫病害研究中，不仅要采集病变组织作标本，还必须考虑采集病根、根际土壤和大田土样进行分离鉴定。

(1)直接观察分离法

对胞囊线虫、根结线虫等植物根部寄生的线虫，可在解剖镜下用挑针直接挑取虫体观察，对一些个体比较大的如茎线虫等，可在解剖镜下用尖细的竹针或毛针将线虫从病组织中挑出来，放在凹穴玻片上的水滴中作进一步观察和鉴定。

(2)漏斗分离法

漏斗分离(Baerman，1917)操作简便，不需复杂设备，适合分离能运动的线虫，是目前从植物材料中分离线虫比较好的方法。其缺点是漏斗内特别是橡皮管道内缺氧，不利于线虫活动和存活，所获线虫悬浮液不干净，分离时间较长。

附图8-2 漏斗分离装置分离装置是将玻璃漏斗(直径10,15cm)，架在铁

1.盛土样的纱布袋

2.铜纱网

3.水架台上，下面接一段(约10cm左右)橡皮管，橡皮管

4.橡皮管

5.弹簧夹

6.小玻管或离上夹一个弹簧夹，其下端橡皮管上再接一段尖嘴玻璃管

心管 (附图8-2)。

具体分离步骤如下:

?在漏斗中加满清水，将带有线虫的植物材料剪碎，用单层纱布包裹，置于盛满清水的

漏斗中。

?经过4,24h，由于趋水性和本身的重量，线虫离开植物组织，并在水中游动，最后都沉降到漏斗底部的橡皮管中，打开弹簧夹，放取底部约5ml的水样到小培养皿中，其中就含有寄生在样本中大部分活动的线虫。

?将培养皿置解剖镜下观察，可挑取线虫制作玻片或作其他处理，如果发现线虫数量少，可以经离心(1500rpm，2,3min)沉降后再检查;也可以在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中。

漏斗分离法也适用于分离土壤中的线虫，方法是在漏斗内的网筛上放上一层细纱布或多孔疏松的纸，上面加一薄层土壤样本，小心加水漫过后静置过夜。

将分离到的线虫挑到凹穴玻片上的水滴中即可作进一步观察和鉴定。

5(实训要求

(1)实训前认真预习实训指导，熟悉本实训的基本操作步骤;

(2)实训中要求严格按照操作规程，进行无菌操作;

(3)通过实训，能掌握病原菌的分离培养技术，并能对病原物进行初步鉴定;

(4)实训中要爱护仪器设备及用具，不得随意损坏;

(5)本实训可安排2学时，培养基的制作、消毒和其它准备工作以及分离后的培养观察可在课外进行。

6(实训考核

1)考核内容

1)是否掌握了植物病原真菌的分离培养和鉴定方法; (

(2)是否掌握了植物病原细菌的分离培养和鉴定方法;

(3)是否掌握了植物病原线虫的分离和鉴定方法。

2)问题思考

(1)病原菌的分离培养过程中应注意哪些问题,

(2)病原菌的分离培养在病原菌的鉴定中有什么意义,

7(实训报告

(1)在老师指导下，选择1~3种农业植物病害材料，按实训操作要求进行分离培养和鉴定，并按下表作好记录:

编号材料病原培养基分离方法消毒剂消毒时间鉴定结果

(2)阐述你在病原物的分离培养过程中出现过哪些问题，是何原因，应如何克服。

附:培养基的制作

1、平板PDA的制作

马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基，简称PDA，主要用于真菌的培养，也可用于细菌的培养。其配方为:马铃薯(或甘薯)200g，葡萄糖(或蔗糖)20g，琼脂17g，水1000ml;将马铃薯洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸30min，用4层纱布过滤;在滤液中加入葡萄糖及琼脂，再继续加热至琼脂完全熔化为止，并补足失水量，保持1000ml。趁热将其分装入洁净的三角瓶或试管内。一般作斜面培养基的试管可

装5ml，作平面培养基的每管约装10ml，而三角瓶内装入培养基的高度不超过瓶身高度的1/4。将管口或瓶口加上普通棉塞塞

紧;病菌分离培养中需要大量无菌水，可将普通自来水用三角瓶或其它耐高温玻璃瓶装好，与做好的培养基一起放入高压灭菌锅内，在15磅压力下经30min左右即可达到灭菌目的。灭菌后的培养基可存放待用。

2、肉汁胨培养基的制作

肉汁胨培养基，简称NA，主要用于细菌的培养。其配方是:牛肉浸膏3g，蛋白胨5,10g，琼脂17g，水1000ml。一般先将牛肉浸膏和蛋白胨溶于水中，酸碱度调至pH6.5,7，放入琼脂后加热溶化即可装瓶消毒灭菌后备用。

农业植物病虫害防治

实训报告

评成绩

语

学时

教师签字日期

姓名学号班级组别

实训8 植物病害病原物的分离培养和鉴定实训编号实训名称

1( 填表:

编号材料病原培养基分离方法消毒剂消毒时间鉴定结果

2(阐述你在病原物的分离培养过程中出现过哪些问题，是何原因，应如何克服。

可附页

?

剪裁线

植物病理学中的病原鉴定方法

植物病理学中的病原鉴定方法植物病原鉴定是植物病理学中的一项重要研究内容。针对植物受到的病害，科学家们致力于确定引起病害的病原微生物。病原鉴定方法的准确性和可靠性对于病害的防治和管理具有重要意义。本文将介绍几种常用的植物病原鉴定方法。 一、病原菌分离与筛选 病原菌的分离与筛选是病原鉴定的首要步骤。通过对受感染的植物组织进行分离培养，可以得到纯种的病原菌。常用的方法包括采样、处理、分离和培养等。从植物组织样品中采集病原菌，经过适当的处理后，将其分离在含有适宜培养条件的培养基上进行培养。同时，还可以通过形态学和生理学特征对病原菌进行初步筛选，以鉴定可能的病原菌。 二、遗传学分析 遗传学分析是病原鉴定的重要手段之一。通过对病原菌的遗传信息进行分析和比对，可以确定其在系统发育中的位置以及与其他相关菌株的关系。常用的遗传学分析方法包括PCR技术、DNA测序、RFLP 等。PCR技术可以扩增特定基因片段以及鉴定病原菌与寄主植物之间的亲缘关系。测序技术可以获取病原菌基因组的完整序列信息。RFLP （限制性片段长度多态性）方法则通过识别特定的限制性内切酶切割位点来进行病原菌的鉴定。 三、免疫学分析

免疫学分析是一种通过检测病原菌与植物寄主之间的免疫反应，来 进行病原鉴定的方法。常用的免疫学分析包括免疫组织化学染色、ELISA以及免疫电镜等。免疫组织化学染色通过使用特异性抗体来标 记病原菌的抗原，从而在组织中检测出病原菌的存在。ELISA（酶联免疫吸附测定法）则通过检测特定抗原与抗体之间的反应来鉴定病原菌。 四、分子检测 随着分子生物学技术的发展，分子检测方法在病原鉴定中得到了广 泛应用。分子检测方法基于病原菌特定的基因序列，通过PCR扩增和 分析来进行鉴定。常用的分子检测方法包括引物特异性PCR、实时荧 光定量PCR、DNA条形码等。引物特异性PCR方法利用特异性引物扩增特定的基因片段，以鉴定病原菌。实时荧光定量PCR方法可对扩增 结果进行实时监测，实现高灵敏度的检测。DNA条形码则利用特定基 因区域的差异来鉴定不同的病原菌。 总结起来，植物病原鉴定方法涵盖了病原菌分离与筛选、遗传学分析、免疫学分析以及分子检测等多个方面。通过综合运用这些方法， 可以对植物病害的病因进行准确鉴定，为病害的防治和管理提供科学 依据。随着科学技术的不断发展，相信将来还会有更多更精确的病原 鉴定方法被开发和应用。

病原物的分离与及培养

病原物的分离与及培养 病原物的分离与培养 一、实验目的 1．学会制作普通的培养基。 2．掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。 二、讲解要点 柯赫氏法则（Koch's Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。其基本步骤如下： 1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物； 2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养； 3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状； 4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。包括培养基的制作和病原物的分离、培养及纯化。 （一）培养基的制作 真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。不同类群的微生物对营养条件的要求不同。因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。培养基就是按照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用

人工的方法配制的基质。 1．常用培养基的配制 植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。 （1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基 这是使用最频繁的培养基，简称PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌的培养。配方为： 马铃薯200g 葡萄糖（蔗糖）10～20g 琼脂17～20g 水1000mL 配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。 （2）肉汁胨培养基 肉汁胨培养基主要用于细菌的分离和培养。可以配成培养液

植物病原菌的分离

植物病原菌的分离 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备 1.分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2.分离用具：酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤 （一）分离前的准备工作： 1.工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2.分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜

实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定

实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定实训8 植物病害病原物的分离培养和鉴定 1(实训目标 通过对植物病原物分离培养方法的学习和实际操作，掌握病原物分离培养的基本原理和基本方法，为植物病原物的鉴定及病害的正确诊断提供依据;了解各种病原物的形态和生物学特性，为植物病害的有效防治打下基础。 2(实训材料 (1)材料新采集的植物真菌、细菌、线虫病害的典型症状植株、PDA培养基、牛汁胨平板培养基等。 (2)仪器用具超净工作台、显微镜、解剖镜、恒温箱、三角瓶、灭菌培养皿、解剖剪、小镊子、移植环、酒精灯、70%酒精、95%酒精、0.1%升汞水或7%漂白粉消毒液、5%来苏尔、灭菌水、滤纸、蜡笔、标签、胶水、火柴、玻璃漏斗(直径10,15cm)、铁架台、橡皮管、弹簧夹、尖嘴玻璃管、网筛、挑针、竹针或毛针、凹穴玻片等。 3(实训内容 (1)植物病原真菌的分离培养; (2)植物病原细菌的的分离培养; (3)植物病原线虫的分离培养。 4(操作步骤与方法 1)植物病原真菌的分离培养 对植物病原真菌通常采用的是组织分离法。此方法的基本原理是:创造一个适合真菌生长的无菌营养环境，促使染病植物组织中的病原真菌在人工培养基上大量生长、繁殖，使其成为纯菌种，以便为病原鉴定和病害诊断提供实物依据。

(1)分离材料的选择及处理 选择新鲜的典型症状植株、器官或组织，洗净，晾干，取新鲜病斑病健交界部分，切成,5mm见方小块用作分离材料。将分离材料置于灭菌的小容器中，先用70%酒精漂洗约2,3 3s，迅速倒去，以避免材料表面产生气泡;然后用0.1%升汞溶液消毒 1~2min(消毒时间因材料厚度不同而异;消毒剂也可根据不同情况选用漂白粉、次氯酸钠等)，再经无菌水漂洗3,4次，最后用灭菌的滤纸吸干材料上的水。 (2)工具的消毒、灭菌 先打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒;分离用的容器和镊子用95%酒精擦洗后经火焰灼烧灭菌。 分离也可在没有尘土而空气相对静止的室内进行，方法是擦净工作台，在台面上铺一块湿毛巾，地面洒水，然后在室内喷洒5%来苏尔熏蒸灭菌2~3h即可。 (3)平板PDA的制作 将三角瓶中的PDA培养基置于水浴锅或微波炉中融化，取出摇匀，自然降温至45?C左右后，在超净工作台上经无菌操作将培养基倒入已灭菌的培养皿中(厚度约2,3mm)，并轻轻摇动，静置台面冷却即成。 (4)分离培养 在无菌操作下用镊子将消毒后的材料移入平板PDA培养基上，按一定距离排列整齐。一般病组织平板培养至少需要3个以上的重复，以增加获得致病菌的机会。在培养皿盖上标明分离材料、日期等。将培养皿底部向上放入塑料袋中，扎紧袋口，置恒温培养箱中在室温 下培养，或置室内阴暗处培养2,5d即可检查结果。 2)植物病原细菌的分离培养 (1)材料处理

病原细菌与真菌实训报告总结与体会

病原细菌与真菌实训报告总结与体会病原细菌与真菌实训报告总结与体会「篇一」 病原菌的分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。 植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。 为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例） 1. 分离的准备工作 （1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。 （2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板；（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。 2. 组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境； （3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。 （5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。 （6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。 （7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定； （8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可保存。 三．病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例） 1.分离的准备工作 （1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变“V”字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉

植物病原细菌鉴定实验指导

植物病原细菌鉴定实验指导 一、实验目的 了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和 生化鉴定技术。 二、实验原理 细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。一般细菌的形态学特征，如 生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生 化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要 通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA 指纹。 三、实验步骤 1、样品收集和处理 收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植 株或部位作为样品。将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙 醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。 2、分离与纯化 将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富 营养培养基有利于分离病原菌。将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。 3、形态学鉴定 观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。如 分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定 的重要参考标准。 4、生理生化鉴定 通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法 可以判断病原菌的代谢类型。如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一 步分类和鉴定细菌的能力。 5、分子生物学鉴定

植物病理学实习报告

《普通植物病理学》实习报告 11植物保护（微生物工程）1班 #### ￥￥￥￥￥￥￥￥￥￥

一、实习目的 通过两周的课程教学实习，巩固和加深对课堂所学知识的理解，将所学的理论知识用于分析实践问题，学会灵活运用课程知识解决生产实践问题，使对知识的掌握上一个台阶。通过实际操作和训练，掌握课程实践教学大纲所规定的专业基本操作和实践技能， 主要包括： 病害标本采集方法、病害调查方法、病害田间诊断方法、不同病原类型（真菌、细菌、病毒、线虫、寄生性种子植物和非侵染性病害）的田间识别和症状观察、培养基制备、病原真菌和细菌的分离培养、线虫的分离和形态观察、病原真菌的玻片标本制作技术、病害鉴定技术、植物病害过塑标本和镜框标本制作法等。 二、实习内容与方法 (一) 植物病害标本的采集和制作及常见病害鉴定 (二) 植物病原的分离与培养 （三）植物病原真菌玻片标本制作 （四）植物病害过塑标本的制作 (五) 线虫的分离 三、实验步骤 标本采集 1、外出实习地点 (1)华农大农场 (2)华农大增城宁西基地 (3)广州白云区蔬菜地 2、采集方式与标本采集要求 (1)直接从病害植株以手、刀、剪刀提取病样。 (2)症状应具有典型性。标本应有典型的病状和病症，最好有不同阶段和不 同部位的症状。这样才能使标本起到帮助人们正确识别病害的作用。 (3)真菌病害标本应采集有子实体的。对于真菌病害来说，鉴定病原物是正 确诊断病害的重要条件之一，因此要求真菌病害标本必须有病菌的子实体。 (4)每种标本上的病害种类应力求单纯。如果一份标本上同时有几种病害， 就会混淆视线，影响鉴定，这样就没有适用价值。 (5)采集时应进行必要的记载，以辅助标本不足。记载的内容应包括：寄主 名称、发病情况、环境条件、以及采集日期、地点、采集人姓名等。 (6)寄主的鉴定也很重要，有些病害如锈病，不知道寄主是无法鉴定的。对 于不认识的寄主植物。应将寄主鉴定所必需的部分，如枝、叶、花及果实等部分都采集齐全。 (7)适于干制的标本，应随采随压于标本夹中，尤其容易干燥卷缩的标本如 水稻、小麦的叶片，最好立即夹在厚书本中，否则叶片失水卷缩后无法展平。 (8)柔软多汁或腐烂的标本，应用纸袋或标本纸包好，然后置于标本箱中， 以免污染和挤坏标本，妨碍鉴定。 (10)黑白粉病、锈病、霜霉类标本等由于病菌孢子极易散落，所以采集时应 用纸袋或标本纸包好后，再置于采集夹中或采集箱中，以免混杂妨碍鉴定。

病原物的分离培养和纯化

病原物的分离培养和纯化 摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。 关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基 目的意义 在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。 1材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1供试材料 新鲜山茶树真菌病叶叶片 1.1.2 试验仪器与用品

真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。 1.2 试验方法 1.2.1试管的制作 用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。制作这样的试管两只。 1.2.2 PDA培养基的制作和灭菌 1.2.2.1 PDA培养基的制作 将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（发霉、变绿的不要）切成小方块，称取200g，倒入锅内，加水1000m L煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻璃棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入葡萄糖10g，琼脂20g，最后加水补足至1000mL。融化后在铁架台上趁热放入试管中，然后斜放制作斜面。 1.2.2.2 PDA培养基和试管的灭菌 将装有PDA的试管和培养皿用高压锅蒸汽灭菌，125℃下30min。冷却后备用。 1.2.3 病原真菌的分离培养 1.2.3.1 病叶剪取 取山茶树新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀剪取病健交界处的病斑小块（3mm×3mm）数块。 1.2.3.2 真菌的分离培养 用酒精棉球将接种箱内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种铲、笔、火柴、病叶组织等试验用具放入接种箱内，密封接种箱。依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。用肥皂洗手后在无菌操作台内用

植物病原菌的分离培养

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。 (一)分离材料的选择 分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。 (二)分离方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离 A:分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。 3．分离材料的选择 用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料 B、植物病原菌的分离 1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离： 首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作： ①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。 ②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）。 ③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。 ④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。 ⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组

植物病原菌分离方法

植物病原菌分离方法 第四章植物病原菌分 离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离 有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料 等发病后分离 组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也 可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3－ 5min；所需时间因材料不同而异，消 毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响

消 毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸 2－3秒 ⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后 使用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较 安全的方法是不用药剂消毒，而 以灭菌水换洗八九次。 培养基的准备 ●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。 寄生性细菌对培养基的要求要比腐 生性细菌严格。 一种适宜于纯培养的培养基不一定

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养.病原物的分离与培养，需经以以几个步骤： 1。有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3。病原菌的分离 4.病原菌的培养。 －、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中,需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。（一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。 1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小,凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长1～2 h.但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧.干热灭菌使用的仪器是烘箱。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌.涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。 进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火;在

农业植物病理学实验指导

农业植物病理学实验指导 农业植物病理学是农业生产中极为重要的学科之一，其研究的是农作物疾病的发生与预防。为了更好地培养学生的病理实验操作能力，本文将提供一份简单的农业植物病理学实验指导。 1. 实验一：植物病原菌的分离和鉴定 实验目的：掌握分离与鉴定植物病原菌的方法，理解病原学的基础概念。 实验原料：感染有病征的植株、消毒剂、无菌玻璃棒、琼脂、静置培养皿、荧光显微镜。 实验步骤： 1. 从感染病株中取样。用无菌玻璃棒在感染病株的表面轻刮几次，然后在无菌培养基上划一条线。 2. 将无菌玻璃棒沾上感染样品，并将其划到无菌培养基上，将其密封，将其放入37℃的温室中培养3-5天。 3. 检查接种坛中的细菌单个斑点，清除任何后来发现的杂细菌，然后进行细菌鉴定，以识别不同的菌株。使用荧光显微镜和其他实验技术来确定不同的菌株。 实验结果： 1. 获得了可研究的植物病原菌。

2. 学生理解了病原学的概念和关键技术。 2. 实验二：植物病害综合鉴定 实验目的：应用综合鉴定法确认植物病害。 实验原料：受感染的植物样品，显微镜、手镰、组织切片、滴定管、生长瓶、测试器。 实验步骤： 1. 阐述农业病害发生的原因和病害的分类。培养出病原 菌后，学生将初步考虑在何种植物病害范围内进行综合鉴定。 2. 制备切片，利用显微镜查看组织细胞的变化，以确定 该病是有效的。 3. 测试样品以确保它是含有特征性病原体的。除了使用 显微镜查看组织切片外，还可以使用滴定管和生长瓶来测试样品的pH、氧含量、有机成分等信息。 4. 将所有数据纳入综合考虑，从而确定植物病害的类型、发展和所需的病虫害防治措施。 实验结果： 1. 确定了植物病害的类型和发展。 2. 学生掌握了植物病害检测的重要步骤。 3. 实验三：生物防治法 实验目的：为学生提供基本原则和技术，了解生物防治如何减少植物病虫害的损失。

植物病理学实习报告_植物设计工作总结

植物病理学实习报告_植物设计工作总结 一、实习内容 本次植物病理学实习主要包括以下内容： 1. 菌株分离鉴定和培养 2. 病害样品的采集和处理 3. 病害的鉴定与诊断 4. 农药的选择和使用 5. 生物防治的方法和应用 6. 植物病害危害评估 7. 土壤和水分环境的分析 二、实习收获 通过实习，我学会了如何从病害的植物组织中分离并鉴定病原菌，并且能够将其培养 出来，给我提供了更好的理解和认识病原菌的结构、基因、生长、发生与侵染规律等相关 知识。 在实习中，我深刻认识到病害样品的采集和处理对病害鉴定和诊断的重要性。通过实 习和老师的指导，我掌握了正确采集病害样品的方法，以及不同病害样品的处理方法，如 处理叶片、干枯枝条、根系等病害组织等。 在实习中，我学习并掌握了不同类型农药的作用机理、使用方法、安全操作要求、使 用量等，比如杀菌剂、杀虫剂和除草剂等农药。同时，我还学会了如何根据病害性质和植 被特点合理选择农药，制定出具有针对性的防治方案。 在实习中，我了解并掌握了各种不同类型的生物防治方法和应用，包括生物制剂、微 生物防治、生物控制等等。生物防治尤其注重的是从生态和环保的角度出发，更好地解决 病害问题。 在实习中，我学习并熟悉了各种不同类型的植物病害危害评估方法，包括有关植物病 害危害评估的法规、标准和指南等。了解如何进行病害危害评估对于预测病害的危害程度、采取合理的防治措施以及对决策的效果评估都非常重要。 6. 掌握了水文环境监测的基本方法

在实习过程中，我了解并掌握了有关水文环境监测的基本方法和技能，包括监测环境水质、水温、水位、水库和水利工程等诸多方面。 三、实习总结 通过本次植物病理学实习的学习和实践，我对植物病害防治相关的理论知识和实际操作技术有更加深入的了解和掌握。同时，我能够更加客观和全面地认识到植物保护工作的重要性和必要性，为今后更好地从事植物保护、助力农业发展，打下了坚实的基础。

病原物分离培养实验报告

四川农业大学《普通植物病理学》实验论文 病原物的分离培养和纯化

病原物的分离和纯化 摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在PDA培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。 关键词：分离培养、炭疽病、PDA培养基、灭菌 前言 柯赫氏法则(Koch’s Rule)又称柯赫氏假设(Koch's postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同”【1】。 如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家

植物病原微生物的分离与纯化

植物病原微生物的分离与纯化 一、实验目的 1、掌握培养基的制备方法，学习灭菌与消毒的操作方法 2、掌握分离与纯化病原微生物的基本原理与方法 二、实验原理 植物病原微生物的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。 植物患病组织内的微生物，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原微生物的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真微生物与其它微生物相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原微生物于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病微生物的分离培养。植物病原真微生物的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 三、实验材料、试剂 芒果炭疽病叶、酒精灯，剪子，镊子，牛肉膏蛋白胨，培养皿，小烧杯，大烧杯，灭菌水，75%酒精瓶、0.1%升汞瓶 四、实验步骤 1、培养基的配置 取无菌平皿，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。 2、植株挑选 用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。 3、分离 ①病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下 ②取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟。 ③消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。 ④用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿4——5块，排放均匀。 ⑤将培养皿倒置，于23—25℃培养 ⑥3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。 4、挑菌纯化 在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步画线分离，或支撑菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。

植物病原真菌的分离培养

植物病原真菌的分离培养 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

实验十三植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位） 酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。 3．分离材料的选择

病原物的分离培养、纯化和人工接种

四川农业大学 论文 植物病理学 姓名：代妮 专业：植物保护 班级：10级2班 学号：20100460 2012/6/25 病原物分离培养、纯化和人工接种

病原物的分离培养、纯化和人工接种 内容摘要：本实验以辣椒炭疽病和茶叶斑病为材料，采用组织分离法分别对其病原真菌进行分离培养、纯化和，再用针刺接种法对其进行人工接种。以柯赫氏法则（Koch’s Postulate）为依据，对辣椒炭疽病和茶叶斑病病原进行鉴定。全过程拟分步实验完成，第一步完成PDA培养基的配置、分装、灭菌、斜面及平板培养基的制作；第二步采用组织分离法，在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片病组织块（进行升汞消毒时间分别为10s、15s、20s、25s四个时间梯度），完成病原真菌的分离，并置于恒温箱内进行培养，3-4天后观察菌落生长情况，发现每个方向都长出菌落，但消毒25s的菌落生长最为茂盛，挑取生长 最茂盛的菌落转移至斜体中进行纯化培养;第三步完成辣椒炭疽病原的针刺接种，定期观察感病辣椒症状,发现与所取辣椒病组织材料症状相同。 关键词：辣椒炭疽病茶叶斑病病原物PDA培养基分离培养纯化人工接种 正文： 1 目的要求 通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用方法，学习常用的接种方法，掌握根据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。 2 用具、试剂与材料 2·1用具：手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、250mL 锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯； 2·2试剂与材料：马铃薯、琼脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、盐酸、漂

植物病原线虫的分离方法及形态观察实验

植物病原线虫的分离 一、目的要求 了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。 二、基本原理 植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。 三、材料、试剂与仪器 1．实验材料感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。 2．仪器或实验用具解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。 3．试剂线虫固定液。 四、实验操作 1．直接观察分离 对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。 取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。 2．漏斗分离法 该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10~ 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10 cm 的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。

植物病原物的分离、培养与接种

植物病原物的分离、培养与接种 一、目的和要求 要求学会植物病原真菌、细菌、病毒和线虫的分离、培养和接种的一般方法，并掌握其基本原理；学习植物传染性病害研究中常用的接种方法，比较不同接种方法对病害发生发展过程与外界环境的差异。 二、材料和用具 新鲜的真菌和细菌病害材料（辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病叶片、水稻白叶枯病叶、烟草花叶病和番茄根结线虫病等）；番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗、水稻白叶枯病菌/稻苗、烟草花叶病/烟草 喷雾器、纱布、酒精灯、酒精缸、火柴、接种饵（针）、长镊子、玻棒、小木块、解剖刀、刀片、载玻片、蒸馏水（滴瓶）、漂白粉精片两研缸、漏斗、皱纹纸、毛笔、针、剪刀、三角瓶、试管、记号笔、标签、金刚砂、保湿罩、弥雾机。70％乙醇、0．1％升汞、灭菌培养皿（吸管）、灭菌水、灭菌培养基（PDA和NA）。 三、内容与方法 3．1 病原真菌的分离和培养植物病原微生物分离和培养工作应该在专门的无菌操作室或超净工作台上进行，但是亦可在清洁和安静的房间中进行。工作时在桌面上铺一块沾湿的纱布，所有工作用具放在湿纱布上，尽量少在室内走动，减少空气流动，以减少污染。选用的分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为活动的状态，生长快，易分离成功。 植物病原真菌的分离有组织分离法和稀释分离法两种，在病组织上产生大量孢子的病原真菌以及病原细菌的分离都可用稀释分离法。 3．1．1 组织分离法按照以下步骤进行： （1）培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注明分离日期、材料和分离人姓名。 （2）培养皿平板制备：用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1－2滴（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼胶培养基一管倒入培养皿中，轻轻摇动使成平面（分离细菌时则不能加乳酸）。 （3）切取病组织小块（叶斑病类）：取新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘切取小块（每边长约3―5毫米）病组织数块。 （4）表面消毒：将病组织小块放入70％酒精中浸数秒钟后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中消毒1―3分钟，然后放入灭菌水中连续漂洗三次。也可用漂白粉精片（1－2片），研磨后加灭菌水10ml，消毒5―10分钟。果实、块茎和枝秆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70％酒精涂拭病部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行2－3次，达到表面消毒。（5）用无菌操作法将病组织小块移至培养基平面上，每培养皿内可放4－5块。 （6）翻转培养皿，放入26－28℃恒温箱内培养，3―4日后观察结果。 （7）用无菌操作法自培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢子，在显微镜下观察。如系玉米小斑病菌孢子，即可用接种针自菌落边缘挑取小块菌落移入斜面培养基，在26－28℃恒温箱内培养，3－4天后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得玉米小斑病菌纯菌种，可置于冰箱中保存。如有杂菌生长，需再次分离获纯培养后，方可移入斜面保存。3．1．2 稀释分离法 以棉花红腐病果为材料，按照下列步骤分离： （1）取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，分别编号（1 、2、3），并注明日期、分离材料及分离者姓名。 （2）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一培养皿中分别注入0．5－1．0ml灭菌水。