向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立

向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立

向日葵黑茎病菌引起向日葵茎斑、叶斑、叶枯、花盘腐烂、茎折倒伏等症状，造成向日葵严重减产及含油率降低，甚至绝收，是一种毁灭性病害。新疆伊犁河谷地区出现了一种危害严重、扩展迅速的向日葵病害，导致向日葵大面积死亡，造成了严重的损失。

我们开展了病原菌分离与鉴定研究，建立了快速的分子检测体系，以期为该病菌的检疫及病害的早期诊断提供技术支持。1.病原菌的分离与鉴定从新疆采集的发病向日葵茎秆、叶片和花盘中，共分离获得20个真菌分离物，经Koch’s 准则证明分离物XJ011和XJ111是引起该病害的病原菌。

采用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4对XJ011和XJ111菌株基因组DNA进行PCR扩增和测序，得到两个菌株的ITS序列长度分别为523bp和525bp，GenBank 注册号分别为AB690462和AB690463，与Leptosphaeria lindquistii （无性态：Phoma macdonaldii）菌株ITS序列的相似度为99%-100%。同时以ITS序列为基础构建系统发育树，结果XJ011和XJ111与Leptosphaerialindquistii聚在了一起，得到了100%的支持率。

XJ011和XJ111菌株菌丝灰白色，菌落边缘不规则，产生大量散生、聚生、半埋生具乳突的分生孢子器。分生孢子器的孔口溢出橙红色或乳白的的分泌物，分泌物中含有大量的分生孢子。

依据形态学特征、序列分析及致病性测定结果，初步鉴定引起新疆伊犁地区向日葵严重病害的病原物为麦氏茎点霉Phoma macdonaldii Boerema。2.向日葵黑茎病菌快速检测体系的建立本实验通过比对向日葵上常见病害病原菌（向日葵菌核病菌、向日葵白粉病菌、向日葵锈病菌、向日葵黄萎病菌、苜蓿黄萎病菌、

变黑轮枝菌、向日葵黑斑病菌、Leptosphaeria dryadis、向日葵茎溃疡病菌、向日葵黑茎病菌）rDNA-ITS序列，在P.macdonaldii多态性丰富的区域设计了一对特异性引物320FOR/320REV。

该引物能从向日葵上常见病害病原菌、腐生菌及Phoma macdonaldii的近缘种菌株中特异的检测出向日葵黑茎病菌。灵敏度可以达到1fg。

向日葵黑茎病和茎溃疡病菌生物学特征、分子检测及检疫处理

向日葵黑茎病和茎溃疡病菌生物学特征、分子检测及检疫处理向日葵是我国重要的油料作物之一,具有较高的营养价值。近几年,我国不断的从国外引进向日葵种子,种子上携带的多种危险性病害传入我国的风险加大。 其中向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是两种重要的检疫性真菌病害,向日葵黑茎病菌在我国局部地区有发生,茎溃疡病菌未在我国出现,为防患于未然,急需建立一种快速的分子检测技术。本文描述了向日葵黑茎病菌在大田危害症状和发生时各个时期症状表现,以及观察两种病原菌和向日葵上寄生的其他病原菌的形态特征,其中包括菌落、分生孢子器、分生孢子。 调研人员在宁夏和新疆向日葵病害田间采集的具有明显病害症状的病残体,本文针对两种病原菌致病症状特征对采集回来的病残体进行实验室分离检疫鉴定。通过形态学以及ITS区域的PCR扩增克隆测序,结果发现,新疆向日葵茎秆编号TXMGX、BXC1、XYHJ为向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii,除此之外,在新疆地区还发现梭孢壳属Thielavia hyalocarpas光黑壳属Preussia sp、向日葵链格孢Alternaria helianth、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、大刀镰孢球黑孢Nigrospora sphaerica,在宁夏地区发现向日葵链格孢Alternaria helianthi与细链格孢Alternaria alternata。 为了建立一种快速检测向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的分子生物学方法,本研究通过收集不同地区的向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌菌株、向日葵上寄生的其他病害以及购买的标准菌株作为供试材料；以油菜黑茎病菌Leptosphaeria biglobosa的肌动蛋白Actin基因设计的一对引物actF/actR;利用actF/actR 对向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌以及向日葵上寄生的其他11种病害菌丝DNA进

向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立

向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立 向日葵黑茎病菌引起向日葵茎斑、叶斑、叶枯、花盘腐烂、茎折倒伏等症状，造成向日葵严重减产及含油率降低，甚至绝收，是一种毁灭性病害。新疆伊犁河谷地区出现了一种危害严重、扩展迅速的向日葵病害，导致向日葵大面积死亡，造成了严重的损失。 我们开展了病原菌分离与鉴定研究，建立了快速的分子检测体系，以期为该病菌的检疫及病害的早期诊断提供技术支持。1.病原菌的分离与鉴定从新疆采集的发病向日葵茎秆、叶片和花盘中，共分离获得20个真菌分离物，经Koch’s 准则证明分离物XJ011和XJ111是引起该病害的病原菌。 采用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4对XJ011和XJ111菌株基因组DNA进行PCR扩增和测序，得到两个菌株的ITS序列长度分别为523bp和525bp，GenBank 注册号分别为AB690462和AB690463，与Leptosphaeria lindquistii （无性态：Phoma macdonaldii）菌株ITS序列的相似度为99%-100%。同时以ITS序列为基础构建系统发育树，结果XJ011和XJ111与Leptosphaerialindquistii聚在了一起，得到了100%的支持率。 XJ011和XJ111菌株菌丝灰白色，菌落边缘不规则，产生大量散生、聚生、半埋生具乳突的分生孢子器。分生孢子器的孔口溢出橙红色或乳白的的分泌物，分泌物中含有大量的分生孢子。 依据形态学特征、序列分析及致病性测定结果，初步鉴定引起新疆伊犁地区向日葵严重病害的病原物为麦氏茎点霉Phoma macdonaldii Boerema。2.向日葵黑茎病菌快速检测体系的建立本实验通过比对向日葵上常见病害病原菌（向日葵菌核病菌、向日葵白粉病菌、向日葵锈病菌、向日葵黄萎病菌、苜蓿黄萎病菌、

真菌（1，3）-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及 ELISA竞争法检测体系的建立

真菌（1，3）-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及 ELISA竞争法 检测体系的建立 严俊;杨葳;翟栓柱;薛知信;郁彭;周泽奇 【摘要】目的：建立高特异性和敏感性的（1，3）-β-D-葡聚糖酶联免疫吸附试 验（ ELISA）检测体系。方法经蛋白修饰的（1，3）-β-D-葡聚糖和真菌提取物作为免疫原制备兔多克隆抗体，并对高效价交叉反应弱的抗体进行纯化和辣根过氧化物酶（HRP）标记，最后建立真菌（1，3）-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。结果建立的ELISA竞争法检测体系线性范围为3．125～200 pg／mL。添加100、25和6．25 pg／mL抗原的血清回收率为97．8％～113．6％，重复试验的变 异系数＜15％。该检测体系能有效地从血清样本中检出低浓度的烟曲霉、白念珠 菌和高浓度的隐球菌，并且对结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌5种细菌抗干扰能力强。结论利用（1，3）-β-D-葡聚糖作为包被抗原，酶标抗体HRP-Ab3B作为检测抗体，成功建立了（1，3）-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。%Objective To develop a competitive enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) with high specificity and sensitivity for fungal (1,3)-beta-D-glucan.Methods Rabbit polyclonal antibody was produced by immunization with protein-conjugated ( 1, 3 )-beta-D-glucan and fungal extract.The highest titer and little cross-reactivity polyclonal antibody was labeled with horseradish peroxidase ( HRP ) and purified.Finally, a competitive ELISA was established for fungal ( 1, 3 )- beta-D-glucan.Results The linear range was 3.125-200 pg/mL.The recovery range for 100, 25 and 6.25 pg/mL serum antigen was 97.8%-113.6%, and the coefficient of variation for repeated test was <15%.The detection

植物病理学与分子生物学的交叉研究

植物病理学与分子生物学的交叉研究 植物是自然界中的生命体，其不仅扮演着维系生态平衡的重要 角色，而且还为人类提供了食物、医药等重要资源。然而，植物 受病害的威胁一直存在，并因此引起了广泛的研究。传统的植物 病理学主要关注病原体、宿主和环境三个要素之间的相互作用， 而随着分子生物学的发展，研究者不仅能够更深入地了解这些作用，而且也能够开展更精确地研究，以应对当前的病害挑战。 分子生物学是研究生物体内分子及其相互作用的科学。通过运 用分子生物学技术，人们可以分离、克隆、检测和定量分析生物 体内的DNA、RNA、蛋白质和代谢产物等分子，为疾病的诊断、 预防和治疗提供了有力的支持。在植物病理学中，分子生物学技 术的应用使得研究者们能够更深入、更具针对性地探究植物免疫 和病害的相关问题。 一、分子生物学技术在植物病理学中的应用 1. 基于PCR技术的特异性检测 PCR技术是重复性聚合酶链式反应的简称，它通过适当的引物 和特定的PCR反应体系，从含有极少量的靶标DNA或RNA的样 本中扩增特定的DNA或RNA片段。在植物病理学中，PCR技术 的最大优点是特异性强、检测灵敏度高和可定量等特点，因此已 被广泛应用于病原体、宿主和病原体-宿主互作分子机理的研究中。

以病原菌检测为例：对于传统的病原菌分离鉴定方法，需要进 行大量的样品处理、筛选和培养，周期长、操作繁琐。而PCR技 术能够从单个细胞、环境样本、病原菌感染组织等样品中快速检 测出含有特定DNA或RNA片段的病原菌，大大缩短了检测时间 和提高了检测准确性。 2. 基因表达分析 基因表达分析是一个研究某一特定条件下生物基因表达模式的 方法。利用RT-PCR、慢性PCR、Northern杂交、基因芯片等技术，可以快速而准确地实现基因表达的分析。植物的细胞和组织对于 病原体感染时会出现一系列反应，同样地，病原体也会启动其相 应的适应反应和毒力反应。基因表达分析可以更深入地揭示植物 和病原体之间的相互作用。 以病原菌侵染植物为例：利用基因芯片或转录组技术分析侵染 后植物细胞的基因表达谱，发现大量的抗病基因和防御反应相关 基因显著上调，而一些生长发育相关的基因则显著下调。这些分 子机理的检测，可以为植物病害的防治提供指导，同时为基于基 因在分子层面的抗病策略开发提供了思路。 3. 基因编辑技术在植物病理学中的应用 基因编辑技术是一种可以直接剪切、替换和插入目标基因的DNA重组技术，它的快速发展和不断成熟为植物病理学研究提供

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用 李天芝;于新友;沈志强 【摘要】参照GenBank中登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因,设计1对引物,扩增片段大小为460 bp的基因片段,该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法,且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点. 【期刊名称】《饲料博览》 【年(卷),期】2015(000)012 【总页数】4页(P24-27) 【关键词】枯草芽孢杆菌;16S rRNA基因;PCR;方法 【作者】李天芝;于新友;沈志强 【作者单位】山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600 【正文语种】中文 【中图分类】S852.61+6;S816.7 枯草芽孢杆菌是一种可形成芽孢的好氧革兰氏阳性菌，该菌具有生长条件简单、耐温度变化、快速复活、快速生长和较强分泌酶等特点[1]。枯草芽孢杆菌是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，在自然界中分布广泛，易于分离培养，

对人畜无毒无害，能产生脂肽类、氨基酸和磷脂类等多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性，可改善动物肠道菌群结构，增强免疫力，促进生长发育，提高生产性能的作用[2-3]。近年来，国内外对于枯草芽孢杆菌在饲料加工方面的应用有大量相关报道。猪饲料中添加一定量的枯草芽孢杆菌，能增强仔猪免疫力、提高生长性能[4]。蛋鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌，即能增加种鸡的产蛋量和合格率，还能提高蛋的受精率、孵化率和健雏率[5]。肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌能改善其肠黏膜的抗氧化和免疫功能，从而提高肉鸡的生长性能[6]。枯草芽孢杆菌添加到奶牛饲料中，能显著提高奶牛产奶性能（P＜0.05）[7]。枯草芽孢杆菌添加到兔饲料中，能显著促进幼兔肠道免疫系统发育[8]。16S rRNA基因可作为细菌鉴定的一种靶基因，在巴氏杆菌、蛭弧菌和链球菌等细菌种属鉴定方面均有相关报道[9]。本研究根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因，设计引物，建立了枯草芽孢杆菌的PCR快速检测方法。 1.1 菌种和试剂 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弗氏弧菌、地衣芽孢杆菌均由实验室保存。DNA回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，马丁肉汤培养基购自北京中海生物科技有限公司，rTaq聚合酶（Polymerase）购自宝生物工程（大连）有限公司。 1.2 引物设计、合成 参照Genbank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列（KF641815），用Primer primer5.0软件分析后，设计1对引物：16S rRNA-F：5'- GGACG⁃GCTGAGTAACACG-3'，16S rRNA-R：5'-GACAA CGCTTGCCACCTA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 PCR模板制备

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立 蒋继滨; 高冬丽; 朱曦鉴; 李灿辉 【期刊名称】《《种子》》 【年(卷),期】2019(038)010 【总页数】5页(P29-33) 【关键词】CRISPR/Cas9; 二倍体马铃薯; 发根农杆菌; StCDF1基因 【作者】蒋继滨; 高冬丽; 朱曦鉴; 李灿辉 【作者单位】云南师范大学马铃薯科学研究院昆明 650500 【正文语种】中文 【中图分类】S532 对植物的基因组进行定点编辑是研究基因功能和作物遗传性状改良的重要方法。CRISPR/Cas 9系统是目前最新一代的基因组编辑技术，其工作原理是核酸酶Cas 9蛋白在向导RNA(short guide RNA，sgRNA)的引导下，对目的基因进行切割，导致双链断裂，双链DNA在修复时会引入碱基的插入、缺失等变异，从而实现目的基因的定点突变[1]。相比于其他基因组编辑系统，CRISPR/Cas 9系统具有构建简单，成本低廉，易于在实验室实现等显著优势，因此目前已广泛应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)以及番茄(Solanum lycopersicum)[2-8]等多种植物的基因组编辑。

马铃薯是全球第四大粮食作物，遗传资源丰富，其中超过70%为二倍体马铃薯， 是马铃薯作物遗传改良的珍贵资源[9]。二倍体马铃薯相对于四倍体基因组简单、 易于转化，因此在二倍体马铃薯材料中利用基因敲除等工具验证基因的功能更容易实现。2015年，Wang等[10]在双单倍体DM中实现了对StIAA2的定点敲除；2017年，Andersson等[11]在四倍体马铃薯的原生质体中通过对StGBSS的定点突变再经过原生质体再生，获得了富含支链淀粉的马铃薯株系；2018年，Ye等[9]通过对二倍体马铃薯S. tuberosum group Phureja S 15-65中的S-RNase的定 点突变获得了可自交的种质，这说明基因组编辑技术在马铃薯中的应用已经相当成熟。然而，稳定的遗传转化是基因功能验证的必要手段，根癌农杆菌介导的二倍体马铃薯遗传转化耗时较长，且存在基因型带来的显著差异，因此建立一套快速验证基因组编辑载体的遗传转化体系十分必要，不仅可以对载体的效率以及靶点的稳定性进行判断，也为后期的稳定遗传转化提供有效的保证。 发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可以侵染植物并在受伤部位诱导产生毛 状根，也叫发状根。发状根具有生长迅速、周期短、多分枝等优点，因此发根农杆菌转化系统被广泛地应用于生产重要次生代谢产物、根发育相关基因的功能验证及植物与微生物间的互作等领域[12]。发根农杆菌相较于根癌农杆菌对于材料的选择较为广泛，对于侵染的材料以及材料的基因型没有特异性选择。更重要的是相较于根癌农杆菌，发根农杆菌分化出发状根的时间更短，更利于遗传转化后的瞬时验证。虽然发根农杆菌侵染马铃薯已有报道[13]，但将CRISPR/Cas 9编辑系统应用于马铃薯发状根尚未见报道。首先CRISPR/Cas 9系统在载体的设计上易出现错误，实验操作中也容易出现难以察觉的碱基突变，对于载体的工作有很大影响；其次对于不同靶点编辑效率，CRISPR/Cas 9系统也有很大的差异性，而利用传统的根癌农杆菌进行遗传转化不仅实验周期慢长，遗传转化效率低。所以用根癌农杆菌遗传转化来验证靶点的设计与分子实验的误差，就加大了整个实验的工作量，延长了实验

马铃薯病毒病RT-PCR检测体系的建立及四川省马铃薯病毒病的种.

马铃薯病毒病RT-PCR检测体系的建立及四川省马铃薯病毒病的种类与分布植物病理学：钟婷婷指导老师：张敏副教授阎文昭研究员马铃薯是一种极易感染病毒的茄科作物，目前已报道的感染马铃薯的病毒多达35种以上，其中危害严重的有6～7种。病毒的侵染除直接引起马铃薯病毒病外，更重要的是导致种质退化，引起产量的急剧下降，成为制约马铃薯生产的主要因素之一。我国主要危害马铃薯的病毒有5种，它们分别是马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、马铃薯S病毒（Potato virus S，PVS）、马铃薯A病毒（Potato virus A，PVA）、马铃薯卷叶病毒（Potato Leaf Roll Virus，PLRV）。 目前，酶联免疫方法是普遍采用的马铃薯病毒检测方法，它可直接提取罹病毒叶片粗汁液检测，在短时间内检测大量样品，因此适宜大量的样品检测，但存在制备血清费时、成本高、灵敏度不足的缺点。病毒基因反转录扩增检测方法（RT-PCR）是一种近年新兴的建立在病毒基因水平的检测方法，具有检测快速，灵敏度高，特异性强的优点，在马铃薯病毒的检测上具有更大的应用前景。目前国内大多省份还没有建立马铃薯病毒RT-PCR方法，因此，针对我国主要发生的马铃薯五种病毒建立RT-PCR检测体系具有重要现实意义，本文根据国内外文献报道的上述五种马铃薯病毒病的扩增引物，分别从感染病毒的马铃薯叶片中提取植物的总RNA，反转录合成cDNA并进行PCR扩增，得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物，分别建立了上述五种马铃薯病毒的RT-PCR检测体系，并将建立的体系实际应用于四川省的马铃薯病毒病的鉴定，在分子水平上为四川省的马铃薯检测提供了新的手段。 四川省近20年来未对马铃薯主产区病毒病的种类和分布进行调查，为了解马铃薯病毒病在四川的种类和分布，为抗病品种选育、建立脱毒种薯的质量控制体系及最终控制马铃薯的退化速度，本研究在四川省马铃薯主产区内平原、丘陵、高山等不同生态区21个县区采集了罹病植株、脱毒试管苗以及薯块等981份样品，利用酶联免疫方法（ELISA），采用8种马铃薯病毒抗血清，对所有样品开展了病毒种类和带毒率的检测鉴定，从而对四川省马铃薯主产区的马铃薯病毒病的种类和分布情况进行了调查。 关键词：马铃薯病毒；酶联免疫（ELISA）；反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）； 病害普查

猪链球菌2型实时荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用

猪链球菌2型实时荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用 李建达;刘俊珍;杜以军;李俊;杨灵芝;王金宝;吴家强;于江;张玉玉;任素芳;陈蕾;郭立辉;孙文博;陈智;王淞 【摘要】试验根据猪链球菌2型荚膜多糖(CPS)抗原设计 CPS2J 基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量 PCR 检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为 y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×101拷贝/μL,是普通 PCR 的10倍；特异性试验 显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌；重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规 PCR 方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。%In this study,a quantitative Real-time PCR method using the specific primers according to CPS 2J gene was established to detect Streptococcus suis serotype 2.The result showed that the equation of standard curve was y=-3.073x+36.87,r =0.995,which demonstrated that the assay had good linear relationship.The melting curve analysis showed that there was only specific peak.Sensitivity test showed that the method could detect the template at the lowest concentra-tion of 1.0×10 1 copies/μL,which was 10 times higher than the ordinary PCR.The specific tests showed that this method could able to detect Streptococcus suis serotype 2 specially and had no
cross-reaction with other serotypes or other bacteria from swine.The CV of repeatability test was 0.37% to 0.63%,lower than 2.5%.The clinical diagnosis showed this assay was more sensitive than ordinary PCR and

多重PCR技术在致病菌检测中的应用进展

多重PCR技术在致病菌检测中的应用进展致病菌污染已成为全球性的公共卫生问题，也是影响食品安全的最主要原因之一，能及 时，准确地检出致病菌是社会发展的需求[1]。传统的微生物培养法是微生物的“金标准”，但 培养法一般需要经过前增菌或增菌、分离培养、生化鉴定及血清学鉴定等几个步骤；整个检 测过程繁琐、耗时长、工作量大,一般需要4～7d才能出检测结果[2-3]。近年来，PCR技术发 展十分迅速,它具有高效、低成本、高灵敏度等优点，其中的多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来的一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加人多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增，具有能一次性检出多种致病菌、灵敏度高、特异性强、快速的优点,并且 随着研究的深入和发展，多重PCR技术在致病菌中的应用领域也越来越广泛[4-5]。 1.多重PCR在致病菌检测的概念和特点 多重PCR是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段 的PCR反应,多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析及RNA检测等。利用一次多重PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值[6]。 多重PCR能一次性检测多种病原微生物或对同一致病原微生物多种分型和毒力，有较强 的高效性、灵敏度；如增菌可在24小时内得出结果，不增菌可在3～5小时内得出结果，自 动化程度高，检出时间短,操作简单，试剂成本相对低，适合检测成组病原微生物[7-8]。 2.多重PCR在致病菌检测中的应用 2.1 用于检测一种或多种不同的致病菌 针对每一种病原的单个特异基因进行多重检测，不同病原菌高度保守基因、特异性基因 和毒素基因设计相应的引物，可同时检测一种或几种病原体的存在与否，进行PCR扩增时， 在同一PCR反应管中同时加入多种病原微生物的特异性引物，能够同时检测多种病原体。李 争等[9]利用大肠埃希菌0157：H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE设计2对引物建立微量快 速检测大肠埃希菌0157：H7的多重PCR方法,经验证该方法特异性、灵敏性和重复性均良好。祝岩波等[10]根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌LasI基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因 和细菌通用16SrRNA基因设计出特异性引物；经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化，特 异性和敏感性的检测，建立多重PCR体系。吴建英等[11]以金黄色葡萄球菌nuc基因、产单 核李斯特菌hlyA基因和沙门菌invA基因设计的特异引物，通过多重PCR对上述3种食源性 致病菌的目的基因进行扩增，同时对反应体系进行优化,认为浓度分别为160、80和40nmol/L 时为实验的最佳浓度，结果显示本实验的检出限为5cfu/ml，具有简便、快速、经济，具有较好的应用前景。李洋洋等[12]为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法，根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡 样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增，结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带，不增菌的情况下，多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL，准确、快速、高效，为同时检测婴幼儿奶粉中的病原微生物检测提供了新方法。陈娟等[13]根据沙门菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的16SrDNA基因、大肠杆菌O157:H7的eaeA基因、单核增生李斯特菌的hlyA基 因和福氏志贺菌的ipaH基因设计5对特异性引物进行多重PCR检测，对反应条件包括 镁离子浓度、引物浓度和退火温度进行优化试验，最佳反应条件为金黄色葡萄球菌、沙门菌 和福氏志贺菌引物浓度为0.25μmol/L，单核增生李斯特菌引物浓度为0.4μmol/L，大肠杆菌0157：H7引物浓度为0.3μmol/L，Mg2+浓度为2.25mmol/L，退火温度为60℃；在此条件下5种病原微生物的多重PCR的DNA检出限分别为6.4、32、32、800和160pg,对实际应用有指 导意义。

牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用

牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用 吴位珩;黄波;杨茂生;姜玲玲;徐景峨;余波;张涛;余国富;杨莉;冯明祥;孙启跃;刘镜【摘要】为快速确诊肉牛牛支原体病,根据牛支原体OPPD/F基因序列设计1对引物,通过反应条件的优化,建立牛支原体PCR诊断方法.结果表明:该方法可从牛肺、鼻拭子临床样本和其临床样本的培养物中直接检测到牛支原体病痛原核酸,该方法可检测的病原核酸最小浓度约为1×10-7μg,整个检测过程仅需3.5h.该方法具有快速、灵敏性高、特异性强等特点,对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义. 【期刊名称】《贵州农业科学》 【年(卷),期】2019(047)005 【总页数】4页(P66-69) 【关键词】牛支原体;OPPD/F基因;PCR 【作者】吴位珩;黄波;杨茂生;姜玲玲;徐景峨;余波;张涛;余国富;杨莉;冯明祥;孙启跃;刘镜 【作者单位】贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;清镇市动物疫病预防控制中心,贵州清镇551400;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省关岭自治县畜牧服务中心,贵州关岭561300;贵州省农业科学院畜

牧兽医研究所,贵州贵阳550005;贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳550005 【正文语种】中文 【中图分类】Q953+.3;S856 牛支原体是危害养牛业的一种主要致病性支原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致眼结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病[1]。1961年，美国人HALE[2]首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体，1976年报道其与牛呼吸系统疾病有关。目前，该病原在世界范围内普遍存在。欧洲每年有25%～33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元，其中英国每 年有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国每年由牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿美元，牛场感染率达70%。自2008年以来，我国大部分省(地区)从外地引入肉牛，爆发了以坏死性肺炎为主要 特征的传染性牛支原体肺炎疫情，多数牛在运输到目的地后1～2周发病，发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，给我国肉牛养殖业造成了巨大的经济 损失[2]。随着我国肉牛养殖规模的不断壮大，北牛南运、北繁南育，引进国外种 牛日益普遍，肉牛的各种疾病也随之而来，肉牛支原体病的发生也呈逐年上升趋势。随着贵州扶贫攻坚的开展，肉牛引进量不断增大的同时也带来了一系列流行病感染问题，而肉牛运输综合症最为突出，项目组2017年1月至2018年6月，对贵州引进肉牛较多的黔西县、大方县、水城县、思南县等养牛场进行了流行病学调查，发现造成贵州省肉牛运输综合症主要病因是肉牛支原体感染，严重的继发巴氏杆菌感染，从而造成死亡。对此，根据牛支原体OPPD/F基因序列保守区间设计引物，建立了牛支原体PCR诊断方法，结合流行病学调查、临床症状及病原菌分离鉴定，

弧菌属PCR检测方法的建立与应用

弧菌属PCR检测方法的建立与应用 刘衍鹏;黄冠军;刘天强;李爱华;肖丹 【摘要】根据弧菌属细菌（ Vibrio spp．）共有的rpoA基因序列，比对和设计 了一对PCR引物，建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法，该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg／μL，对菌液的检测灵敏度为 2．7×102 cfu／mL，能够区分该属细菌与其它属的细菌，具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验，并结合16S rDNA序列 分析，结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌，与测序结果一致，说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。%A pair of PCR primers was designed according to the consensus sequence of the rpoA of Vibrio and a PCR assay for Vibrio spp.was thus established .The PCR assay could distinguish Vibrio spp from bacteria of other genus with great spe-cificity and the sensitivity of the assay was 58 fg/μL for DNA and 2.7 ×10 2 cfu/mL for Vibrio strain.Pathogens isolated from Penaeus vannmei were identified by established PCR and 16 S rDNA sequencing respectively .The result showed that the two assays had great conformity with each other , which indicated that the developed PCR assay can be used to detect Vibrio spp.【期刊名称】《淡水渔业》 【年(卷),期】2015(000)003 【总页数】5页(P88-92) 【关键词】弧菌属细菌;rpoA基因;特异性;检验

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价王慧;罗炜;赖克方 【摘要】目的建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法.方法以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物,以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验.结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为102 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线.结论实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性. 【期刊名称】《临床检验杂志》 【年(卷),期】2010(028)006 【总页数】3页(P407-409) 【关键词】百日咳鲍特菌;聚合酶链反应;实时荧光定量;IS481基因 【作者】王慧;罗炜;赖克方 【作者单位】广州医学院第一附属医院检验科,广州510120;广州医学院第一附属医院呼吸疾病国家重点实验室,广州510120;广州医学院第一附属医院呼吸疾病国家重点实验室,广州510120 【正文语种】中文 【中图分类】R516.6;Q503

百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)是百日咳的病原菌。目前用于诊断百日咳感染的细菌学及免疫学检测存在阳性检出率低、影响因素多、不能早期诊断等不足［1-2］。本研究尝试依据百日咳鲍特菌插入序列IS481基因建立快速检测该菌的实时荧光定量PCR法，并进行评价。 1 材料与方法 1.1 菌种百日咳鲍特菌NCTC 58209购自中国药品生物制品检定所;肺炎链球菌、溶血性链球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌标准菌株由广州医学院检验系提供。 1.2 主要试剂和仪器细菌基因组DNA抽提试剂盒(Qiagen公司)，PCR产物纯化试剂盒及质粒DNA抽提试剂盒(Omega公司)，pCR 2.1载体TA克隆试剂及荧光定量PCR试剂(Invitrogen公司)，Taq DNA聚合酶、常规 PCR 试剂、Marker、X-gal、IPTG(Tiangen公司)，琼脂糖(Biowest公司)，溴化乙锭(Sigma公司)。Ultrospec 110 pro紫外分光光度计(Amersham Biosciences公司)，ABI2720 PCR扩增仪及ABI 7000荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)。 1.3 引物和TaqMan探针按照GenBank中百日咳鲍特菌 IS481基因序列(NM：M22031)，Beacon desiger 7.0软件设计引物IS481A2、IS482B2及探针 IS481(TaqMan)，扩增目的片段大小为116 bp。用Primer 5.0软件设计一对引物IS481A1和IS481B1用于质粒标准品的制备，其扩增片段长度为577 bp。通过Blast验证二组引物及探针的特异性。引物和探针均由Invitrogen公司合成并纯化，探针5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ1荧光猝灭基团，见表1。表1 引物和探针引物及探针序列(5'→3')IS481A1 GTGTCAGCCAGCACCGTCAG IS481B1 GATGCCAGTTGTAGTGGTGTAGC IS481A2 ATGAGCTGGGCATCAAGCAC IS482B2 CTGGTAGGTGTGAGCGTAAGC

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及验证

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及 验证 吴磊;姜朋;张瑜;马鸿翔;张旭 【摘要】为了探讨利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在小麦穗部进行基因沉默的可行性,用大麦条纹花叶病毒诱导苏麦3号小麦穗部PDS基因的转录后沉默,再接种禾谷镰刀菌进行抗性鉴定.结果表明,与接种空载BSMV∶00的对照相比,接种BSMV∶PDS的小麦穗中PDS基因表达量下调了77% (P<0.05).接种BSMV∶00的小麦穗受到赤霉病菌侵染后,穗部平均病小穗数和DON毒素含量分别为2.75个和4.55 μg/g,与接种无菌水对照无显著差异(P>0.05).说明在苏麦3号穗部VIGS 系统中,通过接种病毒能使靶标基因沉默;接种赤霉病菌后,苏麦3号病小穗数和DON毒素含量不受接种病毒的影响,对赤霉病菌的抗性保持不变,建立的VIGS体系可以应用于小麦赤霉病抗性候选基因的功能分析.%Virus-induced gene silencing (VIGS) was performed in the spikes of wheat variety Sumai3 by constructing VIGS vectors and silencing PDS, in order to explore the feasibility of gene silencing by VIGS system in spikes of wheat.The results showed that the expression level of PDS in the spikes inoculated by barley stripe mosaic virus(BSMV)∶PDS was reduced by 77% in comparison with that by BSMV∶00 (P<0.05).After infection with Fusarium asiaticum, the average number of diseased spikelets and DON content were 2.75 and 4.55 μg/g,respectively, showing no significant difference with the control group (P>0.05).The results suggested that the VIGS system for spike enabled the target gene silencing.The number of diseased spikelets and accumulation of DON toxin in Sumai 3 were not affected by the virus

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用 李本金;谢世勇;刘裴清;谢廷鑫;陈庆河;翁启勇 【摘要】利用细菌16S-23S rDNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后, 设计1对特异性引物RsF/RsR,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增.结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验 证了其准确性;将引物RsF/RsR与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检 测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物 能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测.此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义. 【期刊名称】《热带作物学报》 【年(卷),期】2014(035)011 【总页数】6页(P2230-2235) 【关键词】烟草;青枯病菌;巢式PCR;分子检测 【作者】李本金;谢世勇;刘裴清;谢廷鑫;陈庆河;翁启勇 【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科 学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省烟草公司南平市公司,福建南平 353000;福建省农业科学院植物 保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州350013

【正文语种】中文 【中图分类】S435.72 由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的烟草青枯病是威胁世界烟草生产的一种毁灭性病害，广泛分布于热带、亚热带地区。该病在中国南方烟区普遍发生，近年来有逐渐加重的趋势[1-3]。目前对烟草青枯病菌的检测大多 仍采用传统的分离培养和血清学鉴定方法，传统的检测方法耗时长且灵敏度较低，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，免疫血清学鉴定方法虽已建立，但血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，容易造成假阳性[4]，这些方法的应用均受到一定的限制。因此，建立一种 快速、灵敏、准确的烟草青枯病菌检测技术对该病及时、有效地防治具有十分重要的意义。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。国内外应用PCR技术对青枯病菌 的检测研究已有报道，主要是针对青枯菌核糖体基因[1、5]、功能基因[1-3]及未 知片段[6-7]设计引物进行检测，其中核糖体转录间隔区ITS序列是由交替的保守 区和可变区组成，在微生物基因组中以多拷贝出现，具有种的特异性，因此该序列成为在种的水平鉴定细菌极好的目标。目前，具有更高灵敏度的巢式PCR技术已 在一些植物病原菌检测中得以应用[8-10]，但有关烟草青枯病菌的检测鲜有报道[11-12]，且灵敏度不太理想。为此，本研究根据16S-23S rDNA的ITS区段序列在细菌种间高度变异和种内稳定性特点，设计烟草青枯病菌特异性引物，并结合细菌通用引物建立巢式PCR检测体系，对烟草青枯病菌及带菌植株或土壤进行专化 性检测，以期为该病的早期诊断和及时采取有效的防控措施提供技术支撑。

沙门氏菌快速检测技术的研究现状

沙门氏菌快速检测技术的研究现状 孟圆圆;刘丽莉;代晓凝;陈珂 【摘要】沙门氏菌是一类能够引起人畜共患病和食物中毒的食源性病原菌,由其所引起的食品安全事件在我国乃至世界全球范围内一直高居首位,导致人、畜的生命健康受到了严重的威胁.沙门氏菌的灵敏、高效快速检测能够减少或控制食品安全事件的发生.主要基于免疫学及分子生物学这两类快速检测沙门氏菌的方法进行了概述,并对近红外技术、纳米技术等其他快速检测沙门氏菌的方法作简单的阐述,为沙门氏菌快速检测新技术的研究和发展提供了新思路. 【期刊名称】《肉类工业》 【年(卷),期】2018(000)012 【总页数】5页(P42-46) 【关键词】沙门氏菌;食源性病原菌;快速检测;免疫学;分子生物学 【作者】孟圆圆;刘丽莉;代晓凝;陈珂 【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳 471023;河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳 471023;河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳 471023;河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳 471023 【正文语种】中文 沙门氏菌是一类在自然界中普遍存在，可在人和动物的肠道中寄生生存，对人类和动物生命健康造成很大危害，并能引起人畜共患病的革兰氏阴性病原菌。沙门氏菌

的主要传播媒介是通过家禽、蛋、奶、肉类等营养丰富的畜禽产品进行传播，容易污染水源及食品等，是导致人类食物中毒、肠胃炎及动物腹泻等疾病的主要食源性病原菌。目前，已知沙门氏菌的种类有2 213种。在我国每年有3亿人左右因感 染沙门氏菌而患病，占食源性致病菌总致病的70%～80%[1，2]，严重危害人类 身体的健康安全。用于检测沙门氏菌的方法有传统培养法、免疫学方法、分子生物学方法等[3]，传统培养法虽可靠性高，但操作步骤比较繁琐，对工作人员和实验 环境都具有较高的要求，检测周期长，一般需要4～7d才能确定检测结果，不适 合沙门氏菌的快速检测。 近年来，国内外学者对免疫学和分子生物学进行了大量研究，结合传统培养法，研究和开发了一些快速、准确、灵敏度高等特点的沙门氏菌的快速检测方法。本文对沙门氏菌快速检测技术作一概述，为畜产品中沙门氏菌的快速检测提供了一种行之有效的方法。 1 免疫分析检测技术 免疫分析检测技术是利用抗原-抗体这两者之间发生特异型结合反应[4]，根据其基本原理利用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原。基于高特异性沙门氏菌抗体的研制、抗体标记技术的快速发展及应用，将免疫反应与现代沙门氏菌检测技术相结合，实现了沙门氏菌的快速检测，所建立的沙门氏菌免疫学快速检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光法和免疫磁珠分离技术等[5，6]。 1.1 酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫吸附法(ELISA)是将具有免疫活性的抗原或抗体吸附在某种固相载体表面，再将酶标抗原或者抗体及待测样品与其发生特异性结合后，形成抗原一抗体复合物。滴加酶反应底物后，底物被固相载体上的酶高效催化产生颜色反应，可根据底物颜色的深浅程度来判定样品中待测物质的含量[7，8]。ELISA法具有快速、便捷、灵敏等优点，使其得到迅速的发展和广泛的应用。Wang(2015)等[9]制备了鼠伤寒