病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定

发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ]

一、实验目的

系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。

二、知识背景

细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项：

1．病料采集

（1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为：

①全身感染→血液及内脏；

②局部感染→病患部位；

③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织

（2）病料的采集时间也应特别注意：

①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化；

②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。

2．无菌操作

无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。

无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。

无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。

3．培养基

培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。

（1）制作培养基的基本原则

依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。

（2）制作培养基的基本要求

①适宜的水分和各种营养物质；

②适宜的酸碱度与渗透压；

③不含抑制细菌生长的物质；

④应均质透明；

⑤应彻底灭菌；

⑥对某些微生物必须提供一些特殊物质。

（3）培养基的种类

①基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分。

②加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物。

③选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。

④鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。

⑤厌氧培养基：利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；可用于厌氧性细菌的分离和培养。

4．细菌在培养基上的生长情况

单个细菌在培养基表面生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群落称为菌落，它是由数以万计相同的细菌集合而成。众多细菌在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体称为菌苔。

①菌落的形态特征

大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。

据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：

光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。

粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。

粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。

②菌落溶血特征

α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；

β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；

γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。

③色素

有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。

④气味

某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。

细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。

（3）半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

5．分离细菌所要满足的培养条件

（1）适宜的培养基条件；

（2）适宜的温度条件；

（3）适宜的气体条件。

三、细菌的分离方法

细菌分离就是把病料中的病原菌或把目的菌从微生物的混合材料中分离培养出来，并获得目的菌的单一生长材料，从而进行诊断及有关研究工作。

1．待检材料的处理

无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。

（1）加热处理法

当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75℃水浴30min(或80℃ 15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。

（2）接种易感动物

把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。

（3）化学药品处理

有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。因此可

将适宜的化学药品加入培养基中。如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；

2．平板划线分离培养法

（1）培养基平板的准备

取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。

（2）各种物品的准备

取出待检病料，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。

（3）平板划线

以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。

右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。

（4）培养物的观察

病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有，则需进一步检查菌落是否纯一。

当从临床病料中分离细菌时：多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。

3．厌氧菌的分离培养法

通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：厌氧培养箱、厌氧肉汤

4．细菌的纯培养与移植接种

分离培养的目的就是要获得纯培养。细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯

培养是一个细菌的后代。细菌的移植接种就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。

四、细菌的培养技术

根据目的和要求的差异，可采取不同的培养方法

1、表面培养

又称固体表面培养。将细菌液均匀地接种于固体培养基表面,平放静置培养，然后收集菌苔。

2、深层培养

将细菌液接种于液体培养基进行培养。包括液体静置深层培养和生物反应器（发酵罐）深层培养。

3、透析培养

根据小分子能透过半透膜扩散，而将不同分子量的物质分离原理设计的一种细菌培养装置进行细菌培养。

五、细菌的生化试验

细菌由于其种类不同，对营养物质的吸收与排出，分解与合成的能力不同，这与细菌本身所固有的和环境诱导的酶有密切关系，细菌在自然界是一种巨大的生化动力，在它们的代谢过程中往往同时产生多种代谢产物，有些对人类有利，有些会引起动植物和人类疾病，细菌的这些合成和分解代谢产物具有种的特异性，我们可借此来进行细菌种的鉴定。

1、氧化型与发酵型（O/F）的测定

（1）原理

不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。

（2）培养基

成分：蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香草酚蓝（BTB）12mL，蒸馏水1000mL

制法：将蛋白胨、琼脂、盐类和水混合，加热融解，调pH为7.2，然后加葡萄糖和指示剂，混合加热10min，分装试管，加塞包装，115℃高压蒸汽灭菌20min，取出使成琼脂柱。

（3）试验方法

①用18-24h斜面培养物接种于两管O/F培养基，穿刺接种，距管底有一定距离。

②加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F试验管作发酵试验

③ 37℃下孵育48h或更长点时间

（4）结果判定

①只在没有覆盖石蜡油的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型（或呼吸型）

②两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型

2 、糖类分解（发酵）试验

（１）原理

细菌分解糖的能力是受遗传基因控制的，是细菌含有直接分解糖的酶或诱导产生的酶作用的结果，是细菌种的特征的表现，可帮助细菌的鉴定，含糖培养基中含有指示剂，若某细菌分解糖则产酸（发酵）或产酸产气（氧化），会使培养基的指示剂改变颜色，可判断细菌是否分解某种糖或醇或其他碳水化合物。

（２）培养基

需氧菌常用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的琼脂＋1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇（见附录）（有市售各种微量发酵管也可用）。厌氧菌用含胨、盐、硫羟代乙醇酸钠、琼脂的高层半固体培养基半指示剂同上。

（3）试验方法

①琼脂斜面培养物用接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！）。

②若所要接种的细菌营养要求高，则需要先将糖发酵管加热融化后，再加几滴除菌的马血清（牛血清也可），摇匀待凝固后再行接种（如巴氏杆菌、布鲁氏菌等）。

③将接种管标记清楚放人37℃孵育，24-48h观察结果，有的菌对某一糖的发酵属迟缓作用，则需要培养一个月之久。

（4）结果判定

无变化－培养基不变色

产酸＋培养基变黄

产酸产气⊕培养基变黄并有气泡

3、淀粉水解试验

（1）原理

有的细菌具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈蓝紫色反应。

（2）培养基与试剂 3%可溶性淀粉琼脂平板（见附录）和革兰氏碘溶液（见附录一）

（3）试验方法

①将细菌划线接种于3%可溶性淀粉琼脂平板上，在37℃培养24h。

②取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。

③培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环（即淀粉酶阳性）。

4、吲哚（靛基质）试验

（1）原理

有些细菌（如大肠埃希氏菌）能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。

（2）培养基：邓亨氏蛋白胨水溶液（见附录）。

（3）试剂：

①欧立希氏（Ehrlich's）试剂②Kovac's试剂

对位二氨基苯甲醛 1g 对位二氨基苯甲醛 5g

无水乙醇 95ml 戊醇（或异戊醇） 75ml

浓盐酸 20ml 浓盐酸 25ml

先用乙醇溶解试剂后加盐酸，避光保存。

（4）试验方法

①试管试验法：以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于邓亨氏蛋白胨水溶液中，置37℃培养24-48h （可延长4-5d）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2-3mL，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入欧立希氏或Kovacs试剂2mL。在戊醇或二甲苯下面的液体变为红色者为阳性反应。

②斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上；滴加1-1.5ml试剂液于滤纸上使其变湿；取18-24h血琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上；在1-3min内棕色的试剂由紫红变为红色者为阳性。

③加热试验法：将一小指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同一处加滴上两滴高硫酸钾（K2S2O8）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸；将被检试管放入烧杯或搪瓷缸水浴煮沸为止；脱脂棉上出现红色者为阳性。。

5、甲基红（M.R）试验／维倍（V-P）二氏试验。

（1）原理

甲基红是一种pH指示剂，pH的变色范围为pH4.4（红色）—pH6.2（黄色），当细菌分解培养基中葡萄糖产酸，且产酸量大致使培养基在加入甲基红指示剂后显红色为阳性。V-P试验则是某些细菌能使葡萄糖发酵而产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇，乙酞甲基甲醇又变成2,3,丁二烯醇，2,3,丁二烯醇在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色化合物。通常M.R和V-P试验是密切相关的，如果一个微生物M.R是阳性，则V-P是阴性；或者相反。这个试验对区别大肠埃希氏菌与肠杆菌是特别有用的。

（2）培养基葡萄糖蛋白胨水溶液（见附录）。

（3）试剂

① M.R试剂

甲基红 0.02g

95%酒精 60mL

蒸馏水 40mL

② V.P试剂

甲液：α萘酚酒精溶液（α萘酚5g无水乙醇100mL）

乙液：KOH溶液（KOH 40g，水100mL）

将甲液和乙液分装棕色瓶中，于4-10℃保存。

或

硫酸铜 1g

浓氨水 40mI

10%KOH 950mL

蒸馏水 10mL

待溶解后分装棕色瓶中备用。

（4）试验方法

? M.R试验：接种细菌于培养基中，在37℃培养24-48h后。于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应，桔红到黄色则为阴性。

? V-P试验:取出培养24hV.P试验用葡萄糖蛋白胨溶液lmL。将6%小萘酚酒精溶液0.5mL加入，随后加16%KOH 0.5mL，轻摇，然后让其静置10-15min。在15min内出现红色者则为阳性，1h后可出现假阳性。

6、柠檬酸盐利用试验

（1）原理

在这个培养基中柠檬酸钠为唯一的碳源，磷酸铵是唯一的氮源，若细菌利用这些盐作为碳素和氮素来源而生长，利用柠檬酸钠则生成碳酸盐以及铵盐被利用所产生的NH3+转变为NH4OH，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝就显出深蓝色。

（2）培养基

西蒙氏（Simmon's）柠檬酸钠琼脂斜面培养基（见附录）。

（3）试验方法

将被检菌纯培养物或单个菌落划线于柠檬酸钠琼脂斜面并在37℃培养24-48h。肠杆菌、枸椽酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长好或培养基显为深蓝色。

7、石蕊牛乳试验

（1）原理

石蕊是一种指示剂，当pH升至8.3时碱性显蓝色，pH降至4.5时酸性显红色；pH接近中性，未接种的培养基为紫蓝色故称紫乳。石蕊也是一种氧化还原指示剂，可以还原为白色，所以，石蕊牛乳（紫乳）是用来测定被检细菌几种代谢性质的一种鉴别培养基。

（2）培养基

加石蕊酒精饱和溶液于新鲜脱脂乳中，分装小管，经流通蒸汽灭菌而成。

（3）试剂

石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30mL的40%乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，连续两次。加40%乙醇总量100mL，并煮沸1min。取用上清液，必要时可加几滴1mol/L盐酸使呈紫色。现多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脱脂乳中加1.2mL 1.6%溴甲酚紫酒精溶液。

（4）试验方法与解释

将被检菌接种于紫乳，置37℃温箱培养，观察结果。若细菌分解乳糖产酸，指示剂变色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。若产酸产气，使牛乳酸凝，气体使凝块中有裂隙，如产气荚膜梭菌呈“暴烈发酵”。若为紫色，表示乳糖虽未分解；若为蓝色表示乳糖虽未发酵，但细菌分解培基中所出现的氮源物质而产碱所致。若指示剂还原则为无色，常出现在酸凝块形成之后。

8、硫化氢试验

（1）原理

凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅（或含醋酸铅的湿润滤纸条）或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。

（2）培养基

①醋酸铅琼脂（见附录）。

②三糖铁琼脂斜面（见附录）。

③营养肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面。

（3）试验方法与解释

①用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，37℃孵育24-48h或更长时间，培养基变黑者为阳性。

②或将纯培养物接种于肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管壁和棉花塞间夹一6.5×0.6cm大小的试纸条（浸有饱和醋酸铅溶液＊），培养于37℃，观察，纸条变黑者为阳性。

9、硝酸盐还原试验

（1）原理

有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐（偶而还会形成NH3+ N2、NO、NO2和NH4OH 的其它产物），若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染料对磺胺苯-偶氮-α-萘胺，这对鉴定细菌是有用的试验（锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且对区别假阴性反应和真阴性反应是有用的）。

（2）培养基

①适用于需氧菌的硝酸钾蛋白胨水。

②适用于厌氧菌的硝酸盐培养基。

（3）试剂

甲液：甲基α-萘胺0.6g 5mo1/L冰醋酸100mL

稍加热溶解，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中，4-10℃保存。

乙液：对氨基苯磺酸0.8g 5mol/L冰醋酸100mL

先用5mo1/L冰醋酸30mL溶解对氨基苯磺酸，再加冰醋酸至100mL。放入带玻璃塞的玻璃瓶中4-10℃保存。

（4）试验方法与解释

用纯菌培养物接种到硝酸盐培养基中，在37℃培养18-24h，再加试剂甲和乙各3-5滴，在30s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是真正的阴性试验。

10、尿素酶试验

（1）原理

细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有尿素酶。

（2）培养基 Christensen's尿素琼脂培养基，内含尿素，蛋白陈和酚红指示剂（见附录）。

（3）试验方法

用接种环将待检菌培养物接种于尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。置37℃培养，于1-6h检查（有些菌分解尿素很快），有时需培养24h到6d（有些菌则缓慢作用于尿素）。阳性反应，则琼脂斜面由粉红到紫红色。

11、接触酶试验

（1）原理

本试验是检测细菌有无接触酶的存在，过氧化氢的形成看作是糖需氧分解的氧化终未产物，因为H2O2的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为接触酶（过氧化氢酶）和过氧化物酶。

（2）试剂 3%H2O2（新配）。

（3）试验方法与解释

可用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H2O2混合物之上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细菌的气溶胶颗粒的形成。也可直接将3%H2O2加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现（血琼脂平板除外）。

12、氧化酶试验

（1）原理

测定细菌细胞色素氧化酶的产生。阳性反应限于哪些能够在氧气存在下生长的同时产生细胞内细胞色素氧化酶的细菌。

（2）试剂

1%四甲基对苯二胺（Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochloride），新鲜配制，装棕色瓶贮存4℃，一个月。

（3）试验方法

加2-3滴试剂于滤纸上，用一搅拌签挑取一个菌落到纸上涂布）观察菌落的反应。阳性反应在5-10s内由粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。也可将试液滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为阳性。也可在菌落上加试液后倾去，再徐徐滴加用95%酒精配制的1%的（α-萘酚溶液，当菌落变成深蓝色者为细胞色素氧化酶阳性。

（4）注意事项

①作时只能使用搅拌签（或铂金环），因为铁丝会出现假阳性反应。

②不要使用含葡萄糖培养基上生长的菌落，因为它的发酵作用会抑制氧化酶的活性，可能给予假阴性结果。

13、苯丙氨酸脱氨酶试验

（1）原理

若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。

（2）培养基与试剂

①培养基：DL-苯丙氨酸2g，氯化钠5g，（L苯丙氨酸1g），琼脂12g，酵母浸膏3g，磷酸氢二钠1g，蒸馏水1000mL，分装于小试管内，121℃高压蒸汽灭菌10min，作成斜面。

②试剂：10% FeCl3水溶液

（3）试验方法

将被检菌18-24h培养物取出，向试管内注入0.2mL（或4-5滴）10%FeCl3，溶液于生长面上，变绿色者为阳性。

14、氨基酸脱羧酶试验

（1）原理

这是肠杆菌科细菌的鉴别试验，用以区分沙门氏菌（通常为阳性）和枸椽酸杆菌（通常为阴性），若果细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基（-COOH），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性。若细菌不脱羧，培养基不变则为黄色。

（2）培养基

基础培养基：蛋白胨5g 酵母浸膏 3g

葡萄糖1g 蒸馏水1000mL

0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL

? 调整pH至6.8，在每100mL基础培养基内，加入需要测定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸应先溶解于1.5%NaOH溶液内。

L-α赖氨酸0.5g＋1.5%NaOH溶液0.5mL

L-α乌氨酸0.5g＋1.5%NaOH溶液0.5mL

? 加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管内，每管1mL，121℃高压蒸汽灭菌10min。

（3）试验方法

1）从琼脂斜面挑取培养物少许，接种于试验用培养基内，上面加一层灭菌液状石蜡。

2）将试管放在37℃培养4d，每天观察结果。

3）阳性者培养液先变黄后变为蓝色，阴性者为黄色。

15、β-半乳糖苷酶（ONPG）试验（Ortho-nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside Test）

（1）原理

细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β-半乳糖苷酶透性酶（β-galactosidase permease），它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗人细胞。另一种为β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），亦称乳糖酶（Lactase），位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24-48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有β-D-半乳糖苷酶（胞内酶），而缺乏β-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，而经培养基中1%乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的透性酶后，始能较快分解乳糖，故呈迟缓发酵现象。ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚（Ortho-nitrphenyl，ONP），故由培养基液变黄可迅速测知β-半乳糖苷酶的存在，从而确知该菌为乳糖迟缓发酵菌。

（2）培养基ONPG培养基

成分：邻硝基酚β半乳糖苷0.6g，0.01mol/L pH7.5磷酸缓冲液1000mL，pH7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。

制法：先将前两种成分混合溶解，滤过除菌，在无菌条件下与1%蛋白胨水混合，分装试管，每管2-3mL，无菌检验后备用。购不到ONPG时，可用5%的乳糖，并降低蛋白胨含量为0.2%-0.5%，可使大部分迟缓发酵乳糖的菌在1d内发酵。

（3）试验方法

取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1-3h或24h，如有β半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。

16、明胶液化试验

（1）原理

明胶是一种动物蛋白质，某些细菌具有明胶液化酶，明胶经分解后，可呈现不同的特征，有利于细菌的鉴定。

（2）培养基明胶培养基（见附录）。

（3）试验方法与注意事项

①分别穿刺接种被检菌18-24h培养物于明胶培养基，置22℃下孵育，观察明胶液化状况。明胶低于20℃凝成固体，高于24℃则自行呈液化状态，因此孵育温度最好在．22℃，但有些细菌在此温度下不生长或生长极为缓慢，则可先放在37℃培养，再移置于4℃冰箱经30min 后取出观察，具有明胶液化酶者，虽经低温处理，明胶仍呈液态而不凝固。

②明胶耐热性差，若在100℃以上长时间灭菌，能破坏其凝固性，此点在制备培养基时应注意。

17、胆汁溶解试验

（1）原理

肺炎链球菌产生自溶酶，它能使正在生长的菌体溶解，使老龄菌落中心下陷，胆盐通过降低培养基与菌体细胞膜之间的表面能力而加速这一过程。本试验常用以鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌。

（2）试剂 2%去氧胆酸钠溶液

（3）试验方法与解释

于被检菌血琼脂平板上找到单个分散的菌落，在其上加一滴试液。再置37℃培养箱中30min 后取出观察菌落，可见菌落消失，或尚有部分保留。培养菌在肉汤中生长，而且固体培养平板上菌落周围一个黑洞（孔）者是D群链球菌的指示。

六、细菌的毒力检测

1．毒力的概念

同种病原微生物不同菌株或毒株的不同程度的致病能力。即致病性的强弱。构成毒力的物质称为“毒力因子”

2．构成毒力的因素

细菌毒力的强弱主要取决于两大方面：侵袭力和毒素

（1）侵袭力

指微生物突破宿主机体防卫屏障，侵入宿主活组织并在其中生长繁殖和向四周扩散的能力。包括：侵袭性酶和菌体表面结构

①侵袭性酶属胞外酶，对细菌本身无毒性作用；但可破坏机体内的一些防止或减低异物向组

织内渗透的物质，从而在感染过程中协助病原菌抗吞噬或扩散。

②菌体表面结构

G－菌：菌毛，受体是糖蛋白。

G+菌：菌体表面的突出物。如A型链球菌的膜磷壁酸,受体是类蛋白和糖蛋白

荚膜和微荚膜：有抗吞噬、抗体液中杀菌物质的作用，使病原菌能留在宿主体内迅速繁殖，产生病变。所以有荚膜的细菌的毒力比该种细菌失去荚膜时的毒力明显增强。

（2）毒素（Toxin）

有些病原微生物能产生强有力的特殊毒性物质，可大大增强微生物的毒害作用，这种毒性物质就叫做毒素。

（3）毒力岛（pathogenicity island，PAI）

毒力岛也称致病岛；是指细菌染色体上分子量较大(通常>30kb)、G+C mol%及密码使用与宿主菌染色体有明显差异的毒力基因簇。

许多病原菌中都存在毒力岛，毒力岛和病原菌的毒力进化密切相关。目前已在致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌等细菌中发现毒力岛的存在。

致病性大肠杆菌常见的毒力岛

① LEE毒力岛（locus of enterocyte effacement）

“黏附和抹平”（attaching and effacing，A/E）

②耶尔森氏菌强毒力岛（high pathogenicity island，HPI）

铁的摄取、色素沉着、鼠疫菌素

3．毒力因子的检测

（1）免疫学方法

（2）细胞试验

（3）动物试验

（4）毒力基因的检测

七、注意事项

微生物学工作必须在一个清洁卫生的环境中进行，实验室的整洁与否直接影响实验效果。在卫生状况差而零乱的实验室中不可能取得好的实验效果；实验室脏、乱，不但增加了污染的机会，同时也影响人的安全和情绪，所以，清洁、明亮的实验环境是顺利开展工作的保障之一；保持实验室清洁是学生进入实验应尽的责任。

学生姓名：班级：

动物种类：

发病情况：

病料来源：

疑似何种细菌感染：

需要提供的培养基：

需要提供的仪器：

预约实验时间：

提交：jsyzcdr@https://www.wendangku.net/doc/e719016787.html,

植物病理学中的病原鉴定方法

植物病理学中的病原鉴定方法植物病原鉴定是植物病理学中的一项重要研究内容。针对植物受到的病害，科学家们致力于确定引起病害的病原微生物。病原鉴定方法的准确性和可靠性对于病害的防治和管理具有重要意义。本文将介绍几种常用的植物病原鉴定方法。 一、病原菌分离与筛选 病原菌的分离与筛选是病原鉴定的首要步骤。通过对受感染的植物组织进行分离培养，可以得到纯种的病原菌。常用的方法包括采样、处理、分离和培养等。从植物组织样品中采集病原菌，经过适当的处理后，将其分离在含有适宜培养条件的培养基上进行培养。同时，还可以通过形态学和生理学特征对病原菌进行初步筛选，以鉴定可能的病原菌。 二、遗传学分析 遗传学分析是病原鉴定的重要手段之一。通过对病原菌的遗传信息进行分析和比对，可以确定其在系统发育中的位置以及与其他相关菌株的关系。常用的遗传学分析方法包括PCR技术、DNA测序、RFLP 等。PCR技术可以扩增特定基因片段以及鉴定病原菌与寄主植物之间的亲缘关系。测序技术可以获取病原菌基因组的完整序列信息。RFLP （限制性片段长度多态性）方法则通过识别特定的限制性内切酶切割位点来进行病原菌的鉴定。 三、免疫学分析

免疫学分析是一种通过检测病原菌与植物寄主之间的免疫反应，来 进行病原鉴定的方法。常用的免疫学分析包括免疫组织化学染色、ELISA以及免疫电镜等。免疫组织化学染色通过使用特异性抗体来标 记病原菌的抗原，从而在组织中检测出病原菌的存在。ELISA（酶联免疫吸附测定法）则通过检测特定抗原与抗体之间的反应来鉴定病原菌。 四、分子检测 随着分子生物学技术的发展，分子检测方法在病原鉴定中得到了广 泛应用。分子检测方法基于病原菌特定的基因序列，通过PCR扩增和 分析来进行鉴定。常用的分子检测方法包括引物特异性PCR、实时荧 光定量PCR、DNA条形码等。引物特异性PCR方法利用特异性引物扩增特定的基因片段，以鉴定病原菌。实时荧光定量PCR方法可对扩增 结果进行实时监测，实现高灵敏度的检测。DNA条形码则利用特定基 因区域的差异来鉴定不同的病原菌。 总结起来，植物病原鉴定方法涵盖了病原菌分离与筛选、遗传学分析、免疫学分析以及分子检测等多个方面。通过综合运用这些方法， 可以对植物病害的病因进行准确鉴定，为病害的防治和管理提供科学 依据。随着科学技术的不断发展，相信将来还会有更多更精确的病原 鉴定方法被开发和应用。

粪便中病原菌的分离培养与鉴定

粪便中病原菌的分离培养与鉴定 [摘要]目的：从粪便中分离、培养和检测病原菌，对于临床治疗及预后调查有一定的价值。粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。此次我们主要分离培养并鉴定粪便标本中的大肠埃希菌和痢疾志贺菌[3]。方法：本文利用伊红美蓝平板培养后的菌落特征，再提纯培养细菌进行革兰染色镜检、动力实验、生化反应。可鉴定粪便标本中的病原菌。 [关键词]革兰染色大肠埃希菌志贺菌分离培养鉴定 1.实验材料与仪器 1.1标本：粪便标本 1.2培养基：普通琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂斜面培养基、营养肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基 1.3试剂：细菌干粉培养基革兰染色法[1]试剂【结晶紫、碘酒、95%乙醇、稀释复红】、糖发酵管【乳糖、葡萄糖】、褔氏志贺菌诊断血清。 1.4仪器：接种环、接种针、酒精灯、试管架、恒温培养箱、显微镜、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁尔灭、灭菌平皿、刻度吸管、吸水纸、橡皮筋。 2.实验过程 2.1细菌的分离与培养 细菌分离培养：伊红美蓝平板分区划线分离（5区）。 无菌操作取粪便标本于固体平板培养基上，采用分区画线分离法培养细菌。于37℃培养24小时，从而分离出单个菌落。 2.2细菌群体生长特征的观察

观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。 粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。紫黑色菌落具 有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。淡粉红色菌落，半透明，直 径1～2mm。 2.3细菌纯培养 粪便标本在伊红蓝平板上，有紫黑色，粉红色两种菌落。分别挑选这两种菌 落在斜面培养基上接种标记，在37℃培养24h。 2.3.1斜面接种法 选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落在平皿底部玻璃上，画个大圈选择菌落，右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，再用灭菌的接种环套 住菌落，轻刮取菌，将其伸入代接斜面试管底部，轻轻向上划线，接接种环退出 斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上，观察斜面培养基。 2.3.2营养肉汤接种 其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体 培养基后，应在体液表面处的管内壁上轻轻摩擦，使菌体从环上脱落，混进培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。 2.4细菌的形态学检查 2.4.1细菌涂片标本制备 采用斜面培养基的少量细菌涂抹在洁净载玻片的生理盐水上，涂抹成直径1 厘米大小的均匀薄膜，自然于干燥后利用外焰固定。从伊红美蓝平板上挑取的紫 黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表 面湿润、光滑、不透明或半透明。 2.4.2革兰染色方法

感染性疾病病原菌分离与鉴定技术

感染性疾病病原菌分离与鉴定技术 随着现代医学的不断发展，对于感染性疾病的防治越来越重视。感染性疾病是由病原微生物侵入人体后引起的一类传染病，包括 细菌性、病毒性、真菌性等多种类型，对于世界人民的身体健康 和社会经济发展都有着严重的威胁。因此，及时准确地分离和鉴 定病原菌对于临床治疗和流行病学研究具有非常重要的意义。 感染性疾病病原菌的分离是指从患者的临床样本中分离出可疑 的病原菌，包括血液、尿液、呕吐物、痰液、脑脊液等。分离要 求样本处理得当，以避免假阳性和假阴性的发生。一般来说，分 离常用的方法有血培养、尿培养、痰培养、脑脊液培养等，根据 具体情况选择不同的培养基和培养条件。现在常用的快速定量检 测方法有PCR、ELISA、荧光定量PCR等。这些方法在分离病原 菌方面的速度和准确度都有了显著的提高，成为目前最常用的方 法之一。 病原菌的鉴定是指对分离出的菌株进行鉴定，确定它的种属和 亚种，这对于准确选择抗生素和设计药物产生重要的指导作用， 同时为对疾病预防和流行病学提供有力的依据。病原菌的鉴定需 要综合运用多种检测方法，包括荧光染色、酵母菌诊断、多位点 重复序列PCR、16S rRNA基因序列等，常见的鉴定方法有手工鉴 定法和自动化鉴定法。手工鉴定法确定每个菌株的隐藏特性，自 动化鉴定法则依赖于荧光分析和基因序列，可以快速精准地鉴定

数百种常见和罕见的病原菌。鉴定结果可以提供临床医生选择适当的治疗方法和针对性的药物，从而提高治愈率和防治效果。 总之，感染性疾病病原菌分离与鉴定技术的不断完善和创新，为医学和卫生事业的发展提供了新的动力，也为预防和控制感染性疾病提供了更有力的技术支持。我们应该认真贯彻落实国家防疫政策，注重对感染性疾病的防治工作，加强对感染性疾病病原菌分离与鉴定技术的研发和应用，为人民群众健康保驾护航，保障社会和谐平稳发展。

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备(2)

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备（2） 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病 生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶 部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病 灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增 菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧 后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用 灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种 环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。划 线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面 轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注 明接种材料、日期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一 小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色 后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。 鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。 血液及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或 用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。 接种后的平板经30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后，检查菌落生长情况，

病原微生物的识别与鉴定方法

病原微生物的识别与鉴定方法病原微生物是引起疾病的微生物，它们的鉴定和识别对于控制 疾病的传播、制定个体化的治疗方案以及预防疫情具有重要的意义。病原微生物鉴定方法包括传统的培养分离、形态学特征鉴定、生化特性鉴定，以及新技术的分子生物学方法。本文将针对这些 方法进行阐述。 一、传统的培养分离和鉴定方法 培养分离是病原微生物识别的最早和基本方法。该方法可以将 微生物直接培养在适当的培养基上，观察其生长状态和形态特征，通过对其生物学特性的分析与比较，最终确定其种类和分类。不 过由于微生物存在生长速度慢、部分菌种喜好特殊培养条件以及 细菌种类过于广泛等困难，该方法仅适用于一部分病原微生物鉴定。 形态学特征鉴定是通过直接观察微生物在培养基上的外观形态 来判断其属于何种类别和科。这种方法相对简单直观，但缺点是 不够准确和客观，结果常因观察者的主观判断而不同。

生化特性鉴定是基于不同微生物在生化培养基或化学试剂中所呈现的特性而定性和鉴定微生物。通过检测微生物的代谢产物和酶特性来鉴定微生物，这种方法准确性较高，但要求检测者具备专业知识和经验。 二、分子生物学方法 随着科技迅猛发展，分子生物学方法作为病原微生物鉴定方法的新兴技术，已经广泛应用于医学实验室。它是通过检测微生物的核酸来确定其属于何种类别和分类。 1. PCR法 PCR法全称聚合酶链式反应，是一种病原微生物鉴定的分子生物学技术。其原理是依靠DNA聚合酶的酶作用使模板DNA的特定序列经过DNA插入和扩增后，在同盟检测中提取出增量DNA 与目的DNA进行比对。该检测方法可在较短时间内确定病原微生物的种类和数量，检测样品量较少，通晓性好，可大大提高诊断速度和准确性。

植物病原细菌鉴定实验指导

植物病原细菌鉴定实验指导 一、实验目的 了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和 生化鉴定技术。 二、实验原理 细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。一般细菌的形态学特征，如 生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生 化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要 通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA 指纹。 三、实验步骤 1、样品收集和处理 收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植 株或部位作为样品。将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙 醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。 2、分离与纯化 将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富 营养培养基有利于分离病原菌。将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。 3、形态学鉴定 观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。如 分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定 的重要参考标准。 4、生理生化鉴定 通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法 可以判断病原菌的代谢类型。如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一 步分类和鉴定细菌的能力。 5、分子生物学鉴定

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

病原体分离与鉴定实验技术

病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。 一、细菌的分离与鉴定 1. 样本采集与处理 首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。 2. 培养与分离 将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。 3. 形态学鉴定 通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。 4. 生理生化鉴定 细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。

5. 血清学鉴定 血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血 杆菌等。 二、病毒的分离与鉴定 1. 细胞培养法 病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。将待测样本接种于合 适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制 等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。 2. 核酸扩增技术 核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。通过PCR、实时 荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进 行病毒的鉴定。 3. 血清学检测 病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。通过血清学检测，可以检 测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。 三、真菌与寄生虫的分离与鉴定 1. 样本采集与处理 对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物 等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。

动物检验检疫学 实验一 动物病原细菌的分离与鉴定

实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征； 确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征： 普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小 麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气 伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽 革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠 2）菌株：致病性大肠杆菌菌株 3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天： 1.）处死小鼠，无菌解剖 2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化； 3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h； 4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征； 第二天 5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。 甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。 柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。 第三天 １.观察现象，滴定检验

病原菌的分离鉴定

竭诚为您提供优质文档/双击可除 病原菌的分离鉴定 篇一：常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有 0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室

处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅

肠道病原菌的分离与鉴定实验报告

肠道病原菌的分离与鉴定实验报告 摘要 本实验旨在分离、鉴定肠道病原菌，并深入了解肠道病原菌对人们健康的影响。本实验采用选择性培养基和生化试剂对样品进行处理和鉴定，最终成功分离出大肠杆菌、沙门菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等肠道病原菌。 引言 肠道病原菌是导致肠胃疾病的主要病因之一。一些细菌和病毒都可引起肠道感染，导致腹泻、呕吐、腹痛等不适症状。有些肠道病原菌很难通过常规的培养方法进行分离和鉴定，因此对于其鉴定至关重要。在临床和实验室中，肠道病原菌的鉴定是非常重要的。在本实验中，我们将通过选择性培养基和生化试剂来分离和鉴定肠道病原菌。 材料与方法 实验所需材料： -食品样品（牛肉、猪肉、家禽产品等） -选择性培养基（MacConkey agar, SS agar, XLD agar） -氯霉素（50μg/ml） -β-半乳糖苷酶 -生化试剂（甲基红、青田霉素、麦芽糖、尿素、甲酸氢钠、甲酸亚铁、碳酸氢铵、硫代硫酸钠、氧化亚铁、硫酸铜、氯化铵、硝酸钴、聚苯乙烯乳胶、过氧化氢） 实验步骤： 1. 食品样品的处理：将样品切成小块，加入100 ml的含氯霉素（50μg/ml)的生理盐水中，放在室温下搅动10分钟，再将悬浮液离心10分钟，取沉淀制备10倍连续稀释液备用。 2. 分离培养：取三个不同的选择性培养基MacConkey agar、SS agar和XLD agar，分别接种均匀悬浮液并用无菌环展开，然后使其在37℃恒温箱中孵化24小时。 3. 生化识别：观察菌落的形态、颜色和表面涂膜，并用生化试剂行革兰染色、甲基红反应、青田霉素试验、尿素酶试验、甲酸氢钠氧化试验、甲酸亚铁还原试验、碳酸氢铵水解试验、硫代硫酸钠还原试验、氧化亚铁试验、硫酸铜凝集试验、氯化铵水解试验、硝酸钴试验、聚苯乙烯乳胶凝聚试验和过氧化氢试验，根据结果进行分类鉴定。

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。

3．培养基 培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。 （1）制作培养基的基本原则 依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。 （2）制作培养基的基本要求 ①适宜的水分和各种营养物质； ②适宜的酸碱度与渗透压； ③不含抑制细菌生长的物质； ④应均质透明； ⑤应彻底灭菌； ⑥对某些微生物必须提供一些特殊物质。 （3）培养基的种类 ①基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分。 ②加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物。 ③选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。 ④鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。 ⑤厌氧培养基：利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；可用于厌氧性细菌的分离和培养。 4．细菌在培养基上的生长情况

细菌分离与鉴定方法

细菌分离与鉴定方法 1.纯培养 纯培养是将混合细菌通过稀释法或不同稀释度悬浮液的涂布、扩散或 稀释平板接种法接种在适宜的培养基上，使各菌种生长成独立的菌落。这 样可以得到洁净的菌液或洁净的菌落。 2.菌落形态观察 经纯培养得到菌落后，可以观察菌落特征，如菌落形状、颜色、大小、边缘等。这些特点有助于初步区分不同的菌种。 3.各种培养基的利用 根据细菌对不同种类培养基的利用差异，可以采用不同种类培养基进 行分离与鉴定。例如，选择亲水性对细菌有选择性的培养基可以分离出产 胆红素的细菌。 4.微生物常规方法 利用常规的生理生化特性进行鉴定，包括氧需求情况（需氧、厌氧、 需气氛）、产气性、产酸性、产胆红素等特征。 5.细胞形态与结构鉴定 利用显微镜观察细菌的形态特征，包括形状、大小、聚集方式等。染 色方法，如革兰氏染色和抗酸染色，可以帮助确定细菌的细胞壁结构、染 色性质、胞内结构等。 6.生化反应测试

通过观察细菌在特定生化反应条件下产生的能量代谢产物，如产气、 酸碱反应等，可以推测出细菌的代谢途径和能力。常用的生化反应试剂盒，如API系统和VITEK系统，可以通过细菌的酶活性、营养利用和代谢产物 等参数对细菌进行鉴定。 7.16SrRNA基因分析 16SrRNA基因是细菌特有的核糖体RNA的组成部分，其序列具有高度 保守性和广泛分布性。通过对16SrRNA基因的测序和比对，可以确定细菌 的亲缘关系和系统发育位置，进而确定细菌的名称和分类。 细菌分离与鉴定方法的选择取决于需求和目标。对于一般的实验室课 程或常规鉴定需要，常规的菌落形态观察、生理生化试验和染色方法可以 满足要求。而对于复杂的鉴定和分类，特别是对于新菌种或未知细菌的鉴定，16SrRNA基因分析是一种非常有力的方法。

禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定(以发表)

禽巴氏杆菌病病原的分离与鉴定 *** *** （***动物疫病预防控制中心***） 禽巴氏杆菌病又叫禽霍乱和禽出血性败血症，是禽类的一种常见接触性败血性传染病，各种类型的禽均可感染并导致死亡。其特征表现为急性败血过程，发病率和死亡率都很高。低毒感染或急性发病之后，可出现慢性的、局部性的疾病。 （一）、病原 1、形态染色 禽巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的，多杀性巴氏杆菌为卵圆形的短小杆菌，少数近于球形，长约0.6~2.5 um（微米），宽约0.2~0.4 um，无鞭毛，不能运动，不形成芽胞。革兰氏染色阴性，多呈单个或成对存在。在组织，血液和新分离培养物中的菌体用美蓝、瑞氏、姬姆萨氏法染色均可着色，菌体呈明显的俩极着色，中间部分着色较浅，很像许多并列的两个球菌，所以又叫两极杆菌。血清型菌株有荚膜，用印度墨汁等染料染色时，可以见到清晰的荚膜。人工培养后及弱毒株，荚膜不明显或消失。 2、培养特征 巴氏杆菌为需氧兼性厌氧菌。在普通培养基上可生长，37℃培养18~24h （小时），可见灰白色，半透明，光滑，湿润，隆起，边缘整齐的露滴状小菌落，直径约1~2 mm（毫米）。本菌在鲜血琼脂，血清琼脂或马丁琼脂平皿上培养，生长良好，不溶血。在肉汤中培养时，初期呈均匀混浊，24h后上清清亮，管底有灰白色絮状沉淀，轻摇时呈絮状上升。新分离的细菌接种到马丁琼脂平皿上，通过45°折光观察，可见菌落有荧光，呈橘红色带金光，边缘有乳白色光带，结构细致，边缘整齐，称为Fo型菌落，对鸡等禽致病

力强；另一类菌落呈蓝绿色而带金光，边缘有红黄色光带，称为Fg型菌落，对鸡等禽致病力较弱。 该菌可利用果糖，甘露糖，蔗糖，产酸不产气；不能利用肌醇乳糖，靛基质，过氧化氢酶，氧化酶和硝酸盐还原阳性，尿素酶阴性，不液化明胶，在麦康凯培养基上不生长，普通琼脂上发育不良或不发育。 3、种类 多杀性巴氏杆菌的抗原结构比较复杂，分类方法有很多种，Garter在1955年用间接血凝试验根据细菌荚膜将其分为A、B、D、E四个型。Rimler 于1987年又发现一种新的荚膜血清型F，[17]Namioka用盐酸除去荚膜做交叉凝集试验，将该菌分为1~12个菌体血清型。至此，本菌的血清型可以用荚膜血清型和菌体血清型合并表示，以阿拉伯数字表示菌体抗原，大写英文字母表示荚膜抗原，如5：A。禽巴氏杆菌多属A型，少数见于D型。经我国学者对禽巴氏杆菌分型研究表明，我国流行的禽源巴氏杆菌大部分均为5：A、8：A及9：A。 多杀性巴氏杆菌的荚膜与其毒力有关，有致病力的菌株如果失去产生荚膜的能力，可导致其毒力的丢失。已有研究表明多杀性巴氏杆菌在体内繁殖可以产生毒素，内毒素是其主要的毒力因子，引发病理过程。 （二）、禽巴氏杆菌的分离与鉴定 （1）、病料采集： 无菌操作采取死亡鸡肝脏、脾脏、心脏,采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心脏内取样。 （2）、涂片镜检： 将肝触片和心血涂片，滴加几滴甲醇，作用2~3 min,自然干燥，然后分别进行革兰氏染色和美兰染色，镜检。 （3）、禽巴氏杆菌分离与纯化： 无菌取急性死亡的鸡的心血、肝分别接种血液琼脂平板、麦康凯培养基

感染病原微生物的分离和鉴定技术

感染病原微生物的分离和鉴定技术病原微生物是引起疾病的原因之一。因此，当怀疑病人患有感 染性疾病时，需要进行微生物分离和鉴定。这项技术可以用于确 定病原微生物的身份、了解病原微生物的潜在危险以及确定最佳 治疗方案。本文将介绍常见的微生物分离和鉴定技术。 1.细菌分离和鉴定 细菌是最常见的病原体之一，因此需要进行细菌分离和鉴定。 一种常用的细菌分离技术是“血平板法”，该技术涉及到将病原体 培养在含有富含营养物质的平板上。之后，将血清添加到平板上，检测是否会有细菌菌落的形成。如果有形成，则表明这个平板上 有可能存在细菌。 鉴定细菌可以通过筛选一系列不同的培养基来实现，例如酸敏素、米斯敦抑制剂、麦康凯脱氧胆汁盐紫、以及气孔试验等。这 些试验基于细菌菌株的不同特征，根据这些特征，可以确定细菌 的身份并提供最佳治疗方法。 2.真菌分离和鉴定

真菌在感染中也扮演着关键角色，因此需要进行真菌的分离和 鉴定。真菌分离可以通过使用含有营养物质的试管培养基，以及 空气稀释，将真菌放置在伏井玻璃中进行。真菌会在此处生长， 并形成真菌菌落。然后，将这些菌落移动至可供鉴定的培养基上。 鉴定真菌通常涉及使用孢子分析、显微镜观察、以及通过生物 技术方法应用基因测序等。这些方法可以帮助确定真菌的身份， 并提供治疗建议。 3.病毒分离和鉴定 病毒分离是通过将病毒放入终端宿主细胞中，利用宿主细胞来 复制病毒。在病毒复制完成后，通过对复制物进行抽取和鉴定， 可以确定病毒的身份。 病毒的鉴定可以通过许多方法来完成，包括免疫学方法、PCR、以及使用重组DNA技术等。这些方法通常涉及到分析病毒抗原的 特征，使用核酸杂交等技术来分析病毒的序列信息，以及将对病 毒有抵抗力的DNA结合到相同的DNA中以产生抗体。

粪便标本细菌的分离与鉴定

粪便标本细菌的分离与鉴定 近年来恶性事件频发，人们对卫生环境的重视程度越来越高。其中公共场所的卫生问题一直是大家非常关心的策题，其中卫生间的卫生状况是大家关注的一大问题，而卫生间内沾满的细菌就是公共卫生问题的主要因素之一。细菌在人体内会引起很多疾病，这些疾病会在不严谨的卫生条件下迅速传播。因此，粪便标本细菌的分离与鉴定在卫生监督和检验规范化中占有非常重要的地位。其中分离与鉴定细菌的关键环节是对细菌菌种的确认，在这个过程中需要用到一些专业知识和技术，本文将对这个问题进行探讨。 一、概述 微生物在环境中广泛分布，粪便中的细菌数量较为庞大，是目前分离和鉴定细菌的常见来源之一。粪便样品可以分离到多种细菌，包括厌氧菌和好氧菌等，这些细菌在卫生和疾病的预防中都具有重要意义。 在粪便标本中分离细菌的过程可以用于： 1. 发现某些疾病的病原体，如肠道病原体、结核杆菌等。 2. 监测某些疾病发病的情况。 3. 对某些疾病的流行趋势进行分析。 4. 对卫生条件的改善进行监督。 二、方法 1. 粪便标本的采集 在采集粪便标本时，需要注意以下几点： （1）标本应在进餐后2小时、饮水后1小时以及对盐类、药物等刺激物质的摄入后24小时采集； （2）采集过程中需注意避免采入纸巾等异物； （3）采集后应尽快送至实验室进行处理。 2. 样品前处理 在进行粪便标本的分离和鉴定前，需要将样品进行一定的前处理。标本的前处理包括：

（1）由于肠道病原体在进入肠道后很快形成固体，因此应使用3%高锰酸钾对标本进行消毒处理。 （2）用无菌的铲子将样品取出，放入1%无菌盐水中，使固体样品充分悬浮。 3. 细菌的分离 在细菌的分离中，需要先进行预处理， （1）按1:9的比例取出1ml的悬浮液，加入无菌的1%葡萄糖盐肉汤中，放入恒温箱（37℃）进行预培养约12小时。 （2）将培养好的液体进行振荡和混合，取出适量的液体，分别用铁锥、铜钩等方法分别划入三个标准平板上，分别进行筛菌剂涂布，静置约20分钟后将平板放入恒温培养箱内培养。具体条件为：46℃，24小时。 （3）对于筛出的典型菌落，要进行进一步的纯化操作。方法是取均匀的菌落数目均匀的菌落，分别接种到新的、无菌的标准平板上，静置10分钟后进行转移。 （1）分离后的细菌需要进行形态和生理生化特性鉴定。形态鉴定包括：形态、大小、颜色、表面形态等特征的观察。生理生化特性鉴定包括：氧气需求量、酸碱度、酶活性、胡萝卜素色素、荧光色素等方面的鉴定。 （2）之后再通过16S rRNA基因测序等手段进行细菌的定性鉴定。 （3）进行了细菌鉴定后，需要进一步确认对应疾病的病原体。可以通过血清学等方法进行进一步的诊断。 三、结论 通过上述过程，能有效地对粪便标本中的细菌进行分离和鉴定，从而进一步确定对应的疾病病原体。通过提高检测的准确性，可以帮助医疗机构和卫生部门及时确认疾病的种类和流行状况，从而指导相应的卫生监督和改善工作。

细菌分离鉴定

细菌分离鉴定 目的要求： 熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。 实验内容： 一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的.分离与鉴定 (一)标本采集 1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。 2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。 3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。 4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。 5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。 6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。 (二)分离鉴定程序 待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。 直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性) 脓、痰、咽拭子 分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素 血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检 ↑ 挑取可疑菌落生化反应 血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定

药敏试验 如培养液混浊时可涂片、染色、镜检 (三)常见临床标本的检查方法 1．脓拭子 在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。 材料 (1) 标本：脓拭子 (2) 培养基：血琼脂平板 (3) 兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片 方法脓汁→ 革兰染色→ 镜检 ↑ 血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况 致病力试验 (1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。 (2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。 (3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。 2.咽拭子 咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本，重点检查病原性球菌。 材料 (1)标本:咽拭子。

细菌分离培养与鉴定程序

细菌分离培养与鉴定程序 一、背景记录 1、猪的临床症状 2、不同猪的发病阶段（早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡） 3、解剖病变（保存好照片） 二、分离用培养基 1、常用培养基：鲜血琼脂培养基、巧克力培养基 2、非常用培养基：麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基 三、病料的选取和保存 1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽 2、得到病料后应该立即进行细菌分离，分离细菌前最长保存时间（在4℃冰箱 内）最好不要超过3-4小时。分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途（需再次接种、需再次触片、需接种动物等等）可先将病料暂存4℃冰箱，但不得超过2天。一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存，多余的病料进行无害化处理。 四、分离路线 1、选择分离细菌的目标脏器： 根据疑似疾病和病理变化确定，一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器，并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价，如：心血中的细菌多为全身感染分布的病原；关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。） 2、分离细菌 一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌（如：副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等）感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。 划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域，然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。这样一方面可保证分离到病料中的细菌，另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便，同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。 如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌，二者互为参

临床病例中病原性细菌的分离及鉴定

实践五临床病例中病原性细菌的分离与鉴定 目的要求 初步把握动物疫病检测的采样技术、病原微生物的接种、分离、培育、纯化技术及鉴定技术 练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 实验原理 为了取得某种微生物的纯培育，一样是依照该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培育条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各类方式分离、纯化该微生物，直至取得纯菌株。 稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离 实验材料 样品：临床病例 培育基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培育基、肉汤培育基、三糖铁培育基。 无菌水：装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。 其它：无菌培育皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。试剂：1万U/mL链霉素液、10％苯酚；剪子，镊子，手术刀，冰块，保温盒，酒精灯 实验步骤 (一)动物疫病检测的采样技术： 重大动物疫病检测中，结果准确与否，样品质量是关键，因此采样人员必需是兽医技术人员，熟悉采样器具的利用，把握正确采样方式，科学采样 采样时注意隔离防护，隔离或防护服进出场要消毒，预备好采样所需的器具 家禽采样需要： 酒精棉、碘酒棉、5ml注射器、无菌棉签、塑料离心管、签字笔、记号笔、采样单等 牛羊采样还需：牛鼻钳、20ml注射器、采血真空管、采样杯、OP液保留容器等 猪采样还需：猪保定器、开口器、扁桃体采样器等 脏器的采取还需：解剖刀、齿锯、剪子、手术刀、镊子、病料保留袋等 所有病原检测样品都需冷藏箱加冰块保留和运输

血清样品的搜集 家畜采血方式： 雏鸡（禽）心脏采血 左手抓鸡，竖折，手持采血针，平行颈椎。从胸腔前口插入，回抽风有回稳中有降时，即把针心向外拉，使血液流入采血针 成年禽心脏采血 助手抓住两翅及两腿，右边握保定，在触及心博动明显处或胸骨前端，背手下部凹处连线的1/2入消毒，垂直或稍向前方刺入2-3cm，回抽见回血时，即把针心各外拉，使血液流入洒血针 成年禽可采取翅静脉采血 助手一手握住禽的两腿，另一手握住两翼，在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向静脉丛刺入，见有血液回流即把针心向外拉，使血液流入采血针，每只禽采血液2-3ml做好标记 牛羊采血方式 牛颈静脉采血 用手按住颈静脉沟的下端及近心端，可看到颈静脉隆起，消毒后在颈静脉隆起 处，针头向头端方向快速刺入，抽取5ml血，采血完毕用酒精棉球按压并拔出 针头 也可采纳尾静脉采血 在牛尾根后下方4-5cm的正中，垂直刺入2-3cm，见有血液回流进入真空采血 管 奶牛可乳房静脉采血 奶牛腹部可看到明显隆起的乳房静脉，消毒后在静脉隆起处，针头向后肢方向 快速刺入，见有血液回流进入真空采血管 羊的采血方式：选用颈静脉采血，方式同牛颈静脉采血 猪的采血方式 耳静脉采血：站立保定，助手使劲在耳根压静脉的近心端，手指轻弹或用酒精棉球反复涂擦耳静脉，使血管扩张，针头沿血管刺入，见有血液回流接入真空采血管前腔静脉采血：保定器让猪头仰起，露出右腋窝，针头从右边向心脏方向刺入，回抽